【摘要】：芥子氣(Sulfur mustard,SM)是一種糜爛性化學戰(zhàn)劑,曾在第一次、第二次世界大戰(zhàn)及兩伊戰(zhàn)爭中廣泛使用,由于其使用最多、最為普遍和傷害較大,被稱為“毒劑之王”。二戰(zhàn)后,日本遺留在中國的化學戰(zhàn)劑以SM為主,時有造成我平民傷害的報道。SM結構簡單,容易合成,易被恐怖分子掌握和利用。美國疾病控制與預防中心2000年4月發(fā)表的關于“生化恐怖戰(zhàn)備計劃”的建議中指出,恐怖分子可能使用的毒劑包括化學戰(zhàn)劑和一般的工業(yè)毒性化合物,但最有可能使用的仍然是神經性毒劑、糜爛性毒劑和氰類毒劑。皮膚、眼及呼吸系統(tǒng)是SM局部中毒的主要靶器官,而骨髓、造血、免疫系統(tǒng)等是SM全身中毒的主要靶器官。SM損傷的作用機理復雜,至今尚未完全闡明,且無理想的防治藥物。因此,研制作用更強、療效更好的新型SM防治藥物是亟待解決的主要問題之一。SM是一種雙功能烷化劑,主要與細胞中的DNA、RNA、蛋白質、碳水化合物和脂肪等生物大分子發(fā)生反應。嚴重的DNA損傷是SM導致細胞死亡的主要原因。SM導致DNA損傷后,許多生化途徑被激活用于保護細胞免于死亡。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(Poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)依賴的DNA損傷修復酶。當SM造成DNA損傷后,PARP-1被迅速激活,PARP-1通過消耗NAD+合成大量的聚腺苷二磷酸核糖(poly(ADP-ribose),p ADPr),而p ADPr會共價結合于PARP-1本身或其他DNA損傷修復相關的核蛋白,從而介導DNA損傷修復。然而,當PARP-1過度激活時則會大量消耗細胞內NAD+,造成能量耗竭甚至細胞死亡。提示PARP-1的激活在SM損傷中有十分重要的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn),PARP-1抑制劑能夠一定程度上的減輕SM造成的病理損傷,表明其在SM損傷中有一定的治療作用。美軍研究表明PARP-1抑制劑能夠減輕SM造成的小鼠皮膚病理損傷50%以上,提示PARP-1抑制劑有望用于防治SM中毒。但也有研究表明,雖然PARP-1抑制劑能夠避免SM損傷造成的NAD+耗竭,但是對細胞存活并沒有明顯的保護作用。而且有研究表明,PARP-1抑制劑能夠減慢SM損傷后DNA的損傷修復速度。因此PARP-1抑制劑抗SM損傷的藥效以及PARP-1在SM損傷中的作用機制并不明確,有待進一步研究和確證。課題組首先合成了美軍正在研究并可能用于防治SM中毒的新型PARP-1抑制劑;另外,目前在腫瘤治療的研究中,出現(xiàn)了新的一批活性及選擇性更強的PARP-1抑制劑,這些新的藥物抗SM損傷的作用效果值得期待。接下來我們對以上化合物進行了體外分子水平的PARP-1抑制活性篩選,然后選擇其中活性較強的化合物在細胞水平及動物水平進行了系統(tǒng)的藥效學評價,并對其作用機制進行了探討。一、PARP-1抑制劑的活性篩選及其抗SM損傷的活性評價首先對化學合成獲得的BPUBA、S001、S002、S003等85個化合物進行了體外分子水平的PARP-1抑制活性篩選,進而選擇其中活性較強的化合物在細胞水平及動物水平進行了其抗SM損傷活性的評價。1.體外篩選PARP-1抑制劑的活性Trevigen's Homogeneous PARP Inhibition Assay是一個利用熒光的高靈敏體外篩選PARP-1抑制劑的系統(tǒng),本部分利用此試劑盒篩選化合物對PARP-1的抑制活性。結果顯示,S001和S003及其類似物的PARP-1抑制活性較高,而BPUBA、S002及其類似物對PARP-1的抑制活性較低,提示后續(xù)研究可重點開展活性較高的S001和S003及其類似物抗SM皮膚損傷的藥效學試驗。2.體外細胞水平的藥效評價體外篩選結果表明,PARP-1抑制劑S001、S003及其類似物對PARP-1有較強的抑制活性,因此后續(xù)研究應用SM損傷的永生化人表皮角化形成細胞(Ha Ca T)模型,對這兩個化合物及其類似物對SM損傷細胞的保護作用進行了體外藥效學評價。應用1000μM SM染毒6h和24h后,Ha Ca T細胞活力均顯著性降低,且隨著染毒時間增加,細胞活力降低更加明顯。S001、S003及其類似物干預后,在染毒后6h,能明顯增加細胞活力;而在染毒后24h,S001、S003等化合物雖然仍然能夠增加SM染毒組的細胞活力,但是這種作用已逐漸降低。結果表明,以上化合物能夠顯著減輕SM導致的細胞死亡,且在染毒后6h時的保護作用明顯優(yōu)于24h。3.整體動物水平的藥效評價應用0.64mg/ear SM染毒,首先建立了小鼠耳廓SM皮膚損傷模型,繼而應用此模型對PARP-1抑制劑進行了整體動物水平的藥效評價。結果發(fā)現(xiàn),0.64mg/ear SM染毒后小鼠耳廓水腫程度顯著性增加,PARP-1抑制劑S003腹腔注射能夠顯著性降低0.64mg/ear SM染毒造成的小鼠耳廓水腫,但是給藥方式改為口服或涂抹給藥時,對0.64mg/ear SM染毒造成的小鼠耳廓水腫則沒有明顯的減輕作用。結果表明,S003給藥方式為腹腔注射時效果較好,但是給藥方式改為口服及涂抹時藥效不明顯。此外,我們應用SM染毒建立了無毛豚鼠SM皮膚染毒模型,并觀察了PARP-1抑制劑S003的藥效。結果發(fā)現(xiàn),SM可以使皮膚紅腫和皮膚血流顯著性增加,腹腔注射給予PARP-1抑制劑S003后能顯著性降低SM造成的皮膚紅腫和皮膚血流增加。二、PARP-1抑制劑在SM損傷中的作用及機制研究綜合體外活性篩選和體內外的藥效評價結果,確定了藥效最好的PARP-1抑制劑S003,繼而在Ha Ca T細胞染毒模型上對其抗SM損傷的作用及其機理進行研究,并探討了PARP-1抑制劑在SM損傷防治中的應用價值。1.PARP-1抑制劑S003對SM所致PARP-1激活的抑制作用應用熒光的高靈敏體外篩選PARP-1抑制劑的試劑盒,檢測了活性最強的PARP-1抑制劑S003及經典的PARP-1抑制劑3-AB對PARP-1的IC50值,評價了其對PARP-1的抑制作用。結果表明,PARP-1抑制劑S003(IC50=60.22n M)抑制PARP-1的能力比3-AB(IC50=10.86μM)強180倍以上。采用免疫熒光法及Western Blot方法,于100μM及1000μM SM染毒后立即給予S003,觀察SM染毒Ha Ca T細胞損傷模型PARP-1的活化及S003對PARP-1活化的抑制作用。結果顯示,100μM和1000μM SM染毒6h后,Ha Ca T細胞內PARP-1活化產物p ADPr的表達均明顯增加,1000μM SM誘導PARP-1的活化程度明顯高于100μM SM。SM染毒后立即應用S003可顯著降低Ha Ca T細胞中p ADPr的表達,在1000μM SM染毒時效果最為明顯。結果提示,SM損傷可導致PARP-1活化,給予S003可以顯著抑制PARP-1的激活,提示S003是一個有效的PARP-1抑制劑。2.PARP-1抑制劑S003對SM所致Ha Ca T細胞及小鼠耳廓皮膚損傷的作用在Ha Ca T細胞SM染毒模型上,觀察了SM不同染毒濃度(100μM及1000μM)染毒6h和24h后S003對細胞活力的作用。結果顯示100μM及1000μM SM可以使細胞活力顯著性降低。在染毒后6 h,給予S003顯著增加了1000μM SM染毒組的細胞活力,而對100μM SM染毒組沒有觀察到藥效。然而在染毒后24h,不論在100μM SM還是1000μM SM染毒條件下,均沒有觀察到S003保護細胞活力的作用。在小鼠耳廓SM染毒模型上,觀察了SM不同染毒濃度(0.16mg/ear,0.64mg/ear)染毒24h后,S003對小鼠相對耳腫程度(REW)及表皮壞死(EN)的作用。結果表明,高濃度SM染毒組(0.64mg/ear)的評分(REW 204.83,EN 3.9)顯著性高于低濃度SM染毒組(0.16mg/ear)的評分(REW 154.67,EN 2.2)。給予PARP-1抑制劑S003后,顯著性降低了高濃度SM染毒組的REW評分(26%)及EN評分(40%),而對低濃度SM染毒組的評分沒有顯著性影響。采用HE染色方法觀察SM對小鼠耳廓皮膚的損害。結果顯示,暴露于0.16mg/ear及0.64mg/ear SM后24h均會造成小鼠耳廓皮膚中度到重度的病理學改變,主要表現(xiàn)為真皮炎癥細胞浸潤、網狀變性及表皮基底細胞壞死,伴隨高嗜酸性粒細胞的細胞質及細胞核固縮。給予S003 24h后對0.64mg/ear SM造成的細胞核固縮有明顯的保護作用,而對0.16mg/ear SM造成的損傷沒有明顯作用。上述結果提示,PARP-1抑制劑S003在Ha Ca T細胞及小鼠耳廓模型上對SM損傷有一定保護作用。3.PARP-1抑制劑S003對SM所致NAD+/ATP耗竭及凋亡壞死的影響國際上已有體內外的實驗證明,SM染毒可以造成PARP-1的過度激活及NAD+含量的降低。我們對本研究中應用的Ha Ca T細胞染毒模型上SM對NAD+/ATP的影響進行了驗證并考察了S003的藥效。結果提示,SM染毒會濃度依賴性地降低細胞內NAD+/ATP含量,而染毒后立即給予S003后對SM造成的NAD+/ATP含量降低有保護作用。此外,SM介導的PARP-1的活化可能會造成細胞壞死或凋亡。因此,通過Annexin V/PI雙染實驗觀察了SM對細胞凋亡和壞死的影響并評價S003的作用。結果表明,SM能造成明顯的細胞凋亡和壞死,給予S003可顯著降低凋亡和壞死的細胞數(shù)目。在接下來的實驗中,我們繼續(xù)研究了S003對凋亡執(zhí)行蛋白Caspase 3活力的影響,以及S003對重要的凋亡信號也就是Caspase 3切割PARP-1的產物c-PARP表達的影響。結果顯示,染毒后6h,隨著SM濃度的增加,Caspase 3的活性及c-PARP的表達也顯著增加,而染毒后立即給予S003會顯著性降低高濃度SM(1000μM SM)染毒造成Caspase 3的激活及c-PARP的表達,而對低濃度SM染毒(100μM SM)造成的Caspase 3的激活及c-PARP的表達沒有顯著性降低作用;染毒后24h,Caspase 3的活性及c-PARP的表達亦顯著性增加,S003能夠顯著性降低100μM及1000μM SM造成Caspase 3激活,而對c-PARP沒有明顯的作用。上述結果提示,PARP-1抑制劑S003對高濃度SM染毒細胞具有保護作用,主要原因可能在于減輕了SM染毒造成的嚴重的NAD+/ATP耗竭及凋亡壞死。S003對低濃度SM所致的細胞損傷沒有保護作用,原因可能在于低濃度SM染毒對細胞損傷較輕,NAD+/ATP消耗及凋亡壞死程度較輕。4.PARP-1抑制劑S003對SM所致DNA損傷的影響當DNA發(fā)生斷裂,DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks,DSBs)的敏感標志物H2AX會在其Ser139位形成磷酸化,H2AX磷酸化的程度與DNA損傷程度密切相關。我們應用流式細胞儀檢測Ha Ca T細胞中H2AX在Ser139位的磷酸化程度,研究SM對DNA損傷的影響及S003的作用。結果表明,染毒后6h和24h SM會顯著性增加H2AX的磷酸化。而S003在染毒后6h對H2AX的磷酸化沒有明顯作用,在染毒后24h進一步增加了SM造成的H2AX磷酸化。這一結果表明PARP-1抑制劑S003可增加SM所致的DNA斷裂。三、PARP-1敲降對SM損傷后Ha Ca T細胞的影響采用RNA干擾的方法,敲降Ha Ca T細胞中的PARP-1,深入研究PARP-1在SM損傷中的作用,具體結果如下。1.PARP-1敲降效率的確定及對SM損傷后Ha Ca T細胞活力的影響通過檢測RNA干擾后,Ha Ca T細胞中PARP-1 m RNA轉錄水平及蛋白含量,確定PARP-1在Ha Ca T細胞上的敲降效率。結果表明,PARP-1敲降效率較高,能夠進行后續(xù)實驗。通過檢測PARP-1敲降對SM染毒后Ha Ca T細胞活力的影響,研究PARP-1敲降對SM所致細胞毒性的作用。結果表明,PARP-1敲降能夠增加細胞活力,減輕SM所致的細胞毒性。2.PARP-1敲降對SM損傷后Ha Ca T細胞凋亡通路的影響通過檢測內源性凋亡途徑的信號p-JNK、p-p53、Caspase 9、外源性凋亡途徑的信號Caspase 8、凋亡蛋白c-PARP的生成和Caspase 3的激活,研究SM染毒后細胞凋亡情況及PARP-1敲降對SM損傷后Ha Ca T細胞凋亡通路的影響。結果表明,PARP-1敲降能夠降低SM染毒后Ha Ca T細胞的凋亡,可能是通過降低內源性和外源性凋亡途徑信號及凋亡蛋白的激活來發(fā)揮作用。3.PARP-1敲降對SM損傷后Ha Ca T細胞Akt/m TOR通路的影響PARP-1可通過影響自噬抑制因子m TOR來參與自噬調節(jié)。為了研究SM染毒后是否對Akt/m TOR通路有影響以及PARP-1如何參與到這個過程中,我們在PARP-1敲降及對照的Ha Ca T細胞上檢測了Akt及m TOR的磷酸化。提示PARP-1下調可能通過Akt/m TOR通路的重新激活來抑制自噬。上述結果提示PARP-1敲降能顯著性的增加SM染毒后Ha Ca T細胞的細胞活力,降低p-JNK、p-p53、Caspase 9、Caspase 8、c-PARP、Caspase 3的激活和Annexin V的染色,進一步證明了降低PARP-1可以通過下調多個凋亡通路的檢查點來抑制SM造成的凋亡。另外,PARP-1敲降還能夠逆轉SM染毒導致的Akt/m TOR通路的抑制,從而可能通過Akt/m TOR的激活來抑制自噬。通過以上研究,本論文主要得出以下結論:1.S003是一種強效的PARP-1抑制劑,其在體外對PARP-1的抑制活性是經典的PARP-1抑制劑3-AB的180倍。2.PARP-1抑制劑S003對SM染毒細胞模型和動物模型均有明顯的保護作用。S003對高濃度SM染毒造成的Ha Ca T細胞活力降低有明顯的保護作用;S003對高濃度SM造成的小鼠耳廓水腫及病理改變有明顯改善作用,對高濃度SM造成的無毛豚鼠皮膚紅腫和皮膚血流增加有明顯的降低作用。3.PARP-1抑制劑S003抗SM損傷的作用主要可能在于改善SM損傷造成的NAD+/ATP耗竭及降低凋亡和壞死。4.PARP-1敲降可減輕SM損傷,而調節(jié)細胞凋亡及自噬相關通路可能是其發(fā)揮保護作用的重要途徑。5.PARP-1抑制劑S003可增加SM所致的DNA斷裂。6.通過進一步研究,S003有望發(fā)展為防治SM中毒的新型藥物�？傊�,本研究首先經過體內外藥效學評價,篩選出了活性最好的強效PARP-1抑制劑S003,進而采用PARP-1抑制劑S003給藥以及PARP-1敲降的方法,對PARP-1抑制劑抗SM損傷的藥效及作用機理進行了研究。結果提示,PARP-1抑制劑對高濃度SM小鼠耳廓染毒模型,無毛豚鼠皮膚染毒模型及Ha Ca T細胞模型均有明顯的保護作用。下調PARP-1抗SM損傷的作用機理主要為減輕SM損傷造成的NAD+/ATP耗竭,降低細胞凋亡壞死及自噬。然而,PARP-1抑制劑S003可增加SM所致的DNA斷裂,提示在應用PARP-1抑制劑治療SM損傷時應考慮到其對DNA的毒性。此外,目前國際上認為PARP-1抑制劑抗SM損傷的作用機理主要為阻止SM導致的能量耗竭及細胞壞死。而我們的研究結果表明,PARP-1在SM損傷造成的凋亡及自噬中也具有十分重要的作用,這也為PARP-1抑制劑抗SM損傷的作用機理研究提供了新的線索。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R96

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本文編號：2412933