【摘要】：在關(guān)節(jié)炎、肝纖維化等炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，巨噬細(xì)胞活化分泌炎癥因子是其發(fā)病的主要特征，而抑制巨噬細(xì)胞的活化是抗炎免疫治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。作為細(xì)胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制分子—SOCS1，在組織損傷和炎癥性疾病的抑制中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在各種類型的腫瘤中，SOCS1的失活都與啟動子區(qū)域高甲基化有關(guān)。為了更進(jìn)一步研究DNA甲基化在巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子中的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過離體觀察SOCS1基因在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的變化，及其對巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子的作用，研究其部分作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)研究內(nèi)容主要含有以下四個(gè)部分： 1.SOCS1在LPS誘導(dǎo)RAW264.7小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的表達(dá)及甲基化的狀態(tài)。 選用RAW264.7(小鼠巨噬細(xì)胞株)為研究對象，利用LPS1μg/ml誘導(dǎo)24h誘導(dǎo)其活化，RT-PCR方法檢測SOCS1，TNF-α，，IL-6的mRNA表達(dá)變化；免疫印跡觀察SOCS1蛋白的表達(dá)變化；Elisa方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子TNF-α，IL-6的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子的過程中SOCS1的表達(dá)降低。利用甲基化特異性PCR（MSP-PCR）檢測LPS誘導(dǎo)的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞活化過程中SOCS1甲基化的狀態(tài)，我們發(fā)現(xiàn)SOCS1基因發(fā)生了高甲基化。 2. SOCS1在DNA甲基化抑制劑作用下發(fā)生了去甲基化及自身表達(dá)的恢復(fù)，進(jìn)而抑制了RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥因子的分泌。 以RAW264.7為研究對象，利用LPS1μg/ml誘導(dǎo)活化24h和5-azadC2μmol/l溫育48h后，RT-PCR方法檢測SOCS1，TNF-α，IL-6的mRNA表達(dá)變化；免疫印跡觀察SOCS1蛋白的表達(dá)；Elisa方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子TNF-α，IL-6的表達(dá)變化。利用甲基化特異性PCR（MSP-PCR）檢測LPS和5-azadC作用的RAW264.7小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中SOCS1基因甲基化的狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5-azadC能使SOCS1去甲基化進(jìn)而恢復(fù)SOCS1的表達(dá)，并抑制炎癥因子TNF-α，IL-6的分泌。 3. DNMT1調(diào)控SOCS1的表達(dá)及其對甲基化的作用研究。 根據(jù)DNMT1的堿基序列設(shè)計(jì)并合成小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)，通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞內(nèi)，熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。RT-PCR檢測SOCS1，TNF-α，IL-6mRNA的表達(dá);Western Blot檢測DNMT1、SOCS1蛋白的表達(dá)；Elisa方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子TNF-α，IL-6的表達(dá)變化。MSP-PCR檢測沉默DNMT1基因后SOCS1甲基化的狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默的DNMT1可以促進(jìn)SOCS1的去甲基化及SOCS1的表達(dá)，進(jìn)而抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7中炎癥因子TNF-α，IL-6的分泌即DNMT1通過介導(dǎo)SOCS1甲基化來抑制炎癥因子的分泌。 4. DNA甲基化抑制劑及DNMT1沉默對SOCS1下游信號通路的影響。 Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活化中p-JAK2，p-STAT3的表達(dá)升高，DNA甲基化抑制劑和DNMT1沉默可抑制p-JAK2，p-STAT3表達(dá)水平。此外，在封閉DNMT1的RAW264.7中沉默SOCS1可以減弱DNMT1對JAK2/STAT3的活化作用，以上結(jié)果表明SOCS1高甲基化活化了下游的信號通路，進(jìn)而促進(jìn)了巨噬細(xì)胞炎癥因子的分泌。
[Abstract]:The activation and secretion of inflammatory factors by macrophages is the main characteristic of inflammatory diseases such as arthritis, liver fibrosis and other inflammatory diseases, and inhibiting the activation of macrophages is the key link of anti-inflammatory and immunotherapy. SOCS1, an inhibitor of cytokine transduction, plays an important role in the inhibition of tissue injury and inflammatory diseases. SOCS1 inactivation is associated with hypermethylation of the promoter region in all types of tumors. In order to further study the mechanism of DNA methylation in the release of inflammatory cytokines from macrophages, we observed the changes of SOCS1 gene in murine peritoneal macrophages in vitro and its effect on the secretion of inflammatory cytokines by macrophages. Part of its mechanism is studied. The main contents of this study are as follows: the expression and methylation of 1.SOCS1 in RAW264.7 mouse peritoneal macrophages induced by LPS. RAW264.7 (mouse macrophage cell line) was selected as the study object. The activation was induced by LPS1 渭 g/ml for 24 h, the mRNA expression of SOCS1,TNF- 偽 and IL-6 was detected by RT-PCR method, and the expression of SOCS1 protein was detected by Western blot. Elisa method was used to detect the expression of TNF- 偽 and IL-6 in the supernatant of cell culture. The results showed that the expression of SOCS1 decreased during the secretion of inflammatory cytokines by macrophages. Methylation-specific PCR (MSP-PCR) was used to detect the status of SOCS1 methylation during the activation of macrophages in RAW264.7 mice induced by LPS. We found that the SOCS1 gene was hypermethylated. 2. SOCS1 induced demethylation and self-expression recovery under the action of DNA methylation inhibitor, which inhibited the secretion of inflammatory factors in RAW264.7 macrophages. RAW264.7 was used to induce activation for 24 h and 5-azadC2 渭 mol/l for 48 h. MRNA expression of SOCS1,TNF- 偽 and IL-6 was detected by RT-PCR method, SOCS1 protein was detected by Western blot. Elisa method was used to detect the expression of TNF- 偽 and IL-6 in the supernatant of cell culture. Methylation-specific PCR (MSP-PCR) was used to detect the methylation of SOCS1 gene in the peritoneal macrophages of RAW264.7 mice treated with LPS and 5-azadC. The results showed that 5-azadC could induce SOCS1 demethylation and restore the expression of SOCS1, and inhibit the secretion of TNF- 偽 and IL-6. 3. DNMT1 regulates the expression of SOCS1 and its effect on methylation. Small interfering RNA (small interfering RNA,siRNA was designed and synthesized according to the base sequence of DNMT1. The transfection efficiency of RAW264.7 cells was observed by using liposome LipofectamineTM2000. The transfection efficiency was observed by fluorescence inverted microscope. The expression of SOCS1,TNF- 偽 and IL-6mRNA was detected by RT-PCR. The expression of DNMT1,SOCS1 protein was detected by Western Blot. Elisa method was used to detect the expression of inflammatory factor TNF- 偽 and IL-6 in the supernatant of cell culture, and MSP-PCR was used to detect the methylation of SOCS1 after silencing DNMT1 gene. The results showed that silencing DNMT1 could promote the demethylation of SOCS1 and the expression of SOCS1, and then inhibit the secretion of TNF- 偽 and IL-6 in RAW264.7 induced by LPS, that is, DNMT1 mediated SOCS1 methylation to inhibit the secretion of inflammatory factors. 4. Effects of DNA methylation inhibitor and DNMT1 silencing on downstream signaling pathway of SOCS1. Western blot assay showed that the expression of p-JAK _ 2 and p-STAT3 was increased during the activation of murine peritoneal macrophages induced by LPS, and DNA methylation inhibitor and DNMT1 silencing could inhibit the expression of p-JAK _ 2 and p-STAT3. In addition, silencing SOCS1 in RAW264.7 blocking DNMT1 can attenuate the activation of JAK2/STAT3 by DNMT1. These results suggest that SOCS1 hypermethylation activates the downstream signaling pathway and promotes the secretion of inflammatory cytokines in macrophages.
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R96

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2411785