【摘要】：海洋作為一個(gè)區(qū)別于陸地的獨(dú)立生態(tài)系統(tǒng),其獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境造就了海洋來源微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物新穎的化學(xué)結(jié)構(gòu)和豐富的生物活性。而作為海洋微生物一個(gè)重要組成部分的真菌資源,因其巨大的生物活性物質(zhì)代謝潛能,儼然成為了天然藥物化學(xué)家尋找活性新藥先導(dǎo)化合物的重要來源。本論文從真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物多樣性和菌株代謝潛能挖掘兩個(gè)方面,以六株不同海洋生境來源的真菌作為研究菌株,對真菌發(fā)酵次級(jí)代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性進(jìn)行了系統(tǒng)全面的研究。本文主要的研究內(nèi)容包括：抗腫瘤活性菌株的分離與篩選；目標(biāo)菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離與純化；化合物結(jié)構(gòu)的鑒定；新穎化合物多種生物活性的評價(jià)；研究菌株代謝潛能的挖掘。從來自廣東和廣西紅樹林來源的16個(gè)泥樣樣品中共分離純化得到真菌300株,通過真菌形態(tài)排重,結(jié)合TLC薄層層析、HPLC指紋圖譜化學(xué)篩選和小鼠P388細(xì)胞毒活性篩選模型的方法,共得到具有顯著抗腫瘤活性且代謝產(chǎn)物豐富的潛力菌株26株。從分離的菌株和實(shí)驗(yàn)室菌株庫中選取了兩株廣東紅樹林泥樣來源產(chǎn)黃青霉Penicillium chrysogenum HDN11-24、黃曲霉Aspergillus flavus HDN11-47,兩株廣西紅樹林泥樣來源真菌Aspergillus sp. HDN11-84, Sarocladium kiliense HDN11-112,一株膠州灣海泥來源真菌Aspergillus westerdijkiae HDN13-512、一株深海泥樣來源青霉Penicillium sp. F23-2,共計(jì)六株活性目標(biāo)菌株作為本論文的研究對象。對六株活性目標(biāo)菌株實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵所得的粗提物,采用實(shí)驗(yàn)室常用的硅膠柱色譜層析、薄層色譜層析、反相ODS柱色譜層析、Sephadex LH-20凝膠柱色譜層析和HPLC柱色譜層析等化學(xué)分離純化手段,從青霉Penicillium sp. F23-2的PYG培養(yǎng)基的搖床發(fā)酵的提取物中分離得到14個(gè)化合物(1-14),大米靜置條件下大發(fā)酵粗浸膏中分離得到12個(gè)化合物(14-26),其突變菌株中分離4個(gè)化合物(27-30)；從菌株HDN11-84的真菌3號(hào)培養(yǎng)基發(fā)酵的提取物中分離得到16個(gè)化合物(31-46)；從菌株HDN11-112的真菌3號(hào)培養(yǎng)基發(fā)酵的提取物中分離得到5個(gè)化合物(47-51)；從菌株HDN13-512的真菌3號(hào)培養(yǎng)基發(fā)酵的提取物中分離得到9個(gè)化合物(52-60)；從產(chǎn)黃青霉HND11-24的真菌2號(hào)液體培養(yǎng)的提取物中分離得到16個(gè)化合物(61-76)；從黃曲霉HDN11-47的真菌2號(hào)搖床培養(yǎng)的代謝產(chǎn)物中分離得到13個(gè)化合物(77-89),總共從六株目標(biāo)真菌中分離純化89個(gè)化合物。同時(shí)對所有分離得到的單體化合物采用質(zhì)譜、核磁共振譜、紅外光譜和紫外光譜、化合物的理化性質(zhì)以及圓二色譜、X-ray單晶衍射和化學(xué)反應(yīng)方法驗(yàn)證全部88個(gè)化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)。所有化合物的結(jié)構(gòu)類型包括：生物堿類化合物36個(gè)(9-10,20-24,27-29,31-46,47-48,52-53,70,73-75,89),聚酮類化合物41個(gè)(1-8,11-19,25,30,49-51,54-69,71-72,76),甾萜類化合物8個(gè)(77-84),其它類化合物4個(gè)(85-88),其中新化合物42個(gè),新天然產(chǎn)物2個(gè)。包括5個(gè)罕見的含氮sorbicilline類單體、二聚、三聚的生物堿化合物(1-5),1個(gè)sorbicilline類二聚體(25),5個(gè)新穎的環(huán)己烯酮類化合物(15-19),2個(gè)NRPS-PKS雜合的大環(huán)內(nèi)脂類化合物(47-48),3個(gè)新穎的桔霉素類化合物(61-62,64),1個(gè)新的xanthone類化合物(63),5個(gè)新的五元內(nèi)脂類化合物(54-58),9個(gè)新的Epidithiodioxopiperazines類化合物(31-46),1個(gè)甾體類化合物(77)以及5個(gè)新的其他類生物堿(24,28-29,52-53)。采用NOEEY、圓二色譜及生物合成途徑的推導(dǎo),確定了化合物(1-5,61,64)的絕對構(gòu)型；通過X-Ray單晶衍射、NOE、化學(xué)反應(yīng)方法和CD確定了化合物(15-19)的絕對構(gòu)型；利用X-Ray單晶衍射、NOESY和Marfy反應(yīng)法,確定化合物(47-48)的絕對構(gòu)型；采用X-Ray單晶衍射方法確定甾體化合物(77)的絕對構(gòu)型；與報(bào)道文獻(xiàn)的旋光數(shù)據(jù)對比確定化合物(63)的絕對構(gòu)型。為了尋找可能潛力的藥物先導(dǎo)化合物,研究分離得到的天然產(chǎn)物的生物學(xué)活性,實(shí)驗(yàn)對部分單體化合物的抗腫瘤、抗菌等生物活性進(jìn)行初步的評價(jià)與篩選。以藥理實(shí)驗(yàn)室常有的A54、BEL-7402, HEK-293等五種腫瘤細(xì)胞株為模型,采用SRB法和MTT法評價(jià)天然產(chǎn)物的細(xì)胞毒活性；以紙片法評價(jià)部分單體化合物對金黃色葡萄球菌、結(jié)核桿菌等致病菌的生物活性。評價(jià)結(jié)果表明化合物1對HCT116腫瘤株有抑制活性(IC50=10/μm),但與此同時(shí)評價(jià)的同類型化合物2-5沒有表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性(IC5010/μm);化合物47-48表現(xiàn)對A549腫瘤細(xì)胞株具有較好的的細(xì)胞毒活性(IC50值分別為4.5μM和6.0μM)；化合物61和64對Hela, BEL-7402, HEK-293, HCT-116, A549腫瘤細(xì)胞株表現(xiàn)出較好的細(xì)胞毒活性(IC50 3.2～10.5 μM);化合物77對HL-60細(xì)胞株有較好的細(xì)胞毒活性(ICso 6.4 μm);化合物34對HL-60和A549有較好的生長抑制活性(在初始濃度在50μM時(shí)的抑制率為78.2%和80.4%)：化合物15-19在抗菌活性的篩選中表現(xiàn)出對金黃色葡萄球菌的良好抑制活性。綜上,本論文對在6株不同海洋生境來源真菌實(shí)驗(yàn)室條件下大發(fā)酵所得的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離,共得到的89個(gè)天然產(chǎn)物,其中包括35個(gè)新化合物和2個(gè)新天然產(chǎn)物。在對新化合物結(jié)構(gòu)的研究中,首次利用ECD計(jì)算的方法確定了含氮sorbiclline類生物堿的立體構(gòu)型,并發(fā)現(xiàn)其具有較好的細(xì)胞毒活性；發(fā)現(xiàn)了一系列具有抗金黃色葡萄球菌活性的環(huán)己烯酮類化合物：同時(shí)發(fā)現(xiàn)并篩選到PKS-NRPS雜合的大環(huán)內(nèi)脂類化合物的抗腫瘤活性；對研究菌株采用OSMAC策略和誘導(dǎo)突變的方式挖掘菌株的代謝潛能,增加了菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性和發(fā)現(xiàn)生物活性良好先導(dǎo)化合物的幾率。上述實(shí)驗(yàn)研究為海洋天然產(chǎn)物化學(xué)研究中菌株代謝潛能的挖掘,化合物結(jié)構(gòu)的確定提供了新的研究方向。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R915

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 楊燁;王e，

本文編號(hào)：2400592