【摘要】：研究背景： 炎癥變化是腦缺血再灌注后腦損傷的重要基礎(chǔ)之一。半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes, CysLTs;包括LTC4. LTD4和LTE4)是一類重要的炎癥介質(zhì),在腦缺血、腦外傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病中起重要作用。CysLTs通過(guò)激活半胱氨酰白三烯受體(cysteinyl leukotriene receptor, CysLTR)起作用。目前,已克隆和鑒定了兩種半胱氨酰白三烯受體(即CysLT1R和CysLT2R). 大鼠局灶性腦缺血后,CysLT1R表達(dá)上調(diào),急性期表達(dá)在缺血中心區(qū)神經(jīng)元,慢性期表達(dá)在缺血中心區(qū)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞以及周邊區(qū)增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞。本課題組已經(jīng)證實(shí)CysLT1R拮抗劑普魯司特、孟魯司特對(duì)大、小鼠局灶性腦缺血模型急性和亞急性/慢性損傷均具有保護(hù)作用。該類藥物發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用可能機(jī)制是抑制缺血急性期血腦屏障通透性增加并調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),減少缺血后期星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖及膠質(zhì)疤痕形成。 CysLT2R表達(dá)于心臟、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、提睪肌脈管系統(tǒng)、腸肌層神經(jīng)元等外周組織細(xì)胞中；在人腦中,CysLT2R表達(dá)在血管平滑肌細(xì)胞及浸潤(rùn)的粒細(xì)胞上,而CysLT1R腦內(nèi)表達(dá)相對(duì)較少。正常大鼠腦組織中,CysLT2R主要表達(dá)于腦室周圍和皮層的星形膠質(zhì)細(xì)胞；大鼠局灶性腦缺血損傷早期CysLT2R表達(dá)于缺血中心區(qū)神經(jīng)元,后期表達(dá)于缺血中心區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞以及周邊區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞,同CysLT1R表達(dá)的時(shí)空特征相似。CysLT2R介導(dǎo)缺血誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的損傷；在星形膠質(zhì)細(xì)胞中,CysLT2R還介導(dǎo)體外缺血損傷或LTD4處理后水通道蛋白AQP4的表達(dá)；這些結(jié)果提示,CysLT2R與腦缺血損傷密切相關(guān),抑制CysLT2R通路可能是一條治療腦缺血損傷的有效途徑。 HAMI3379是近年來(lái)報(bào)道的CysLT2R選擇性拮抗劑,HAMI3379對(duì)CysLT2R親和力遠(yuǎn)強(qiáng)于CysLT1R(約10000倍)。另一種CysLT2R選擇性拮抗劑Bay CysLT2可減輕小鼠心肌梗死、抑制LTD4誘導(dǎo)的耳靜脈伊文思藍(lán)滲出及大鼠動(dòng)脈環(huán)微血管生成,減輕缺血性星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷。新近報(bào)道,HAM3379雖然對(duì)皮層神經(jīng)元OGD/R誘導(dǎo)的損傷無(wú)明顯作用,但可抑制皮層細(xì)胞混合培養(yǎng)體系中細(xì)胞活性下降及LDH釋放,并通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活,減少神經(jīng)元死亡,但是,HAMI3379在整體水平上,對(duì)大鼠局灶性腦缺血損傷是否有保護(hù)作用還需進(jìn)一步研究。 已經(jīng)證實(shí)CysLT2R可通過(guò)激活小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)缺血性神經(jīng)元損傷。BV2細(xì)胞是小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞株,具有原代小膠質(zhì)細(xì)胞的特性,已被廣泛用于相關(guān)研究。那么CysLT2R拮抗劑HAMI3379及CysLT1R拮抗劑普魯司特,對(duì)OGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞激活是否有類似的保護(hù)作用,其有關(guān)的作用機(jī)制是什么?都有待于進(jìn)一步研究。 研究目的： 本研究采用大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)誘導(dǎo)的局灶性腦缺血再灌注模型,及缺氧缺糖(OGD)激活BV2細(xì)胞模型,研究CysLT2R選擇性拮抗劑HAMI3379對(duì)大鼠局灶性腦缺血的治療作用,并闡明對(duì)HAMI3379對(duì)OGD誘導(dǎo)改變的BV2細(xì)胞激活作用及有關(guān)作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)主要分以下2個(gè)方面： (1)首先,以側(cè)腦室注射為給藥途徑,初步觀察HAMI3379對(duì)大鼠局灶性腦缺血急性損傷的保護(hù)作用,并與CysLT1R拮抗劑普魯司特比較。其次,用更接近臨床的給藥方法,進(jìn)一步明確腹腔注射HAMI3379對(duì)大鼠局灶性腦缺血急性及慢性損傷的保護(hù)作用。 (2)研究HAM3379及普魯司特對(duì)OGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞激活、細(xì)胞因子、自噬及受體間相互作用的影響。 研究方法： 用線栓法阻塞大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈(MCAO),制備局灶性腦缺血模型；以神經(jīng)癥狀評(píng)分和斜板實(shí)驗(yàn)觀察動(dòng)物神經(jīng)功能損傷；用激光多普勒血流儀檢測(cè)局部腦血流；以TTC染色法檢測(cè)腦損傷面積及腦水腫；以甲苯胺藍(lán)或尼氏染色觀察神經(jīng)元形態(tài),以Fluoro-Jade B染色法觀察變性神經(jīng)元；以免疫組織化學(xué)法觀察血腦屏障通透性的變化、小膠質(zhì)細(xì)胞、激活的小膠質(zhì)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化；以免疫熒光組織化學(xué)法觀察存活神經(jīng)元、以CBA法檢測(cè)大鼠血清及腦脊液中IFN-γ, IL-4, IL-10含量,以ELISA法檢測(cè)大鼠鼠血清及腦脊液中IL-1β、IL-6. TNF-α含量。 在離體實(shí)驗(yàn)中,MTT還原試驗(yàn)和LDH釋放試驗(yàn)觀察不同OGD時(shí)間及恢復(fù)時(shí)間對(duì)BV2存活的影響,確定誘導(dǎo)BV2細(xì)胞激活及損傷的OGD/R條件。免疫熒光共染法確定CysLT1R和CysLT2R表達(dá),觀察自噬的變化,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BV2熒光微珠吞噬的吞噬功能,用流式細(xì)胞儀及Annexin V/PI試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,用PLA法確定CysLT1R-CysLT2R相互作用。用CBA法測(cè)定BV2細(xì)胞的上清液中TNF、 IL-6的釋放。用Real-time PCR法測(cè)定BV2細(xì)胞中IL-2, IL-6、 IL-17a. IL-10. EGR-2、 IL-4、 TNF和IFN-Y等細(xì)胞因子的變化。 研究結(jié)果： 第一部分HAMI3379對(duì)大鼠局灶性腦缺血的治療作用 HAMI3379側(cè)腦室術(shù)前給藥(100ng)對(duì)MCAO大鼠血糖、平均動(dòng)脈壓、二氧化碳分壓、血氧分壓,血糖、pH值及血流變化模式無(wú)影響。缺血再灌注24h后,HAMI3379(10,100ng)能顯著地減少神經(jīng)癥狀評(píng)分,提高斜板角度,減少梗死體積,減輕腦水腫,抑制神經(jīng)元的丟失,壞死及缺血側(cè)半球皮層及紋狀體梗死區(qū)IgG滲出,該作用與普魯司特相似。CysLT2R shRNA側(cè)腦室注射可明顯減少大鼠局灶性腦缺血／再灌注24h腦梗死體積及腦水腫,這些結(jié)果證明,HAMI3379對(duì)大鼠局灶性腦缺血的急性損傷具有保護(hù)作用并且是CysLT2R依賴的。 HAMI3379腹腔注射給藥(0.1mg/kg)對(duì)MCAO大鼠平均動(dòng)脈壓、血糖等生理指標(biāo)無(wú)影響。各組間死亡率無(wú)顯著差異。HAMI3379對(duì)大鼠局灶性腦缺血急性期損傷的保護(hù)作用具有劑量及時(shí)間依賴性。HAM3379腹腔注射的有效劑量0.1-0.4mg/kg, HAMI3379腹腔注射的作用時(shí)間窗是1h。HAMI3379對(duì)大鼠缺血再灌注24,72h的損傷均具有改善作用,即可減少神經(jīng)功能損傷、減輕腦梗死、腦水腫及缺血側(cè)神經(jīng)元丟失與壞死. HAMI3379可減少M(fèi)CAO術(shù)后24h的血清、腦脊液中IL-1β、 EFN-Y-TNF-a釋放。HAMI3379還可抑制MCAO術(shù)后72h缺血側(cè)半球MPO浸潤(rùn),抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活,但對(duì)該時(shí)間點(diǎn)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生無(wú)明顯抑制作用。與HAMI3379比較,CysLT1R拮抗劑普魯司特對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活及IFN-γ釋放無(wú)作用,但可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生,減少血清中IL-4的釋放。上述結(jié)果表明,腹腔注射HAMI3379對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后24～72h損傷具有保護(hù)作用,并且,可以減少小膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)的炎癥,進(jìn)一步證實(shí)CysLT2R可作為腦缺血治療的新靶點(diǎn)。 HAMI3379(0.1mg/kg, i.p.)術(shù)后連續(xù)給藥6d,與普魯司特作用相似,能顯著減少大鼠MCAO術(shù)后0-7d的神經(jīng)癥狀評(píng)分,提高斜板角度,減輕大鼠MCAO術(shù)后14d的腦萎縮,減少缺血周邊區(qū)的神經(jīng)元丟失,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生。以上結(jié)果提示HAMI3379對(duì)大鼠局灶性腦缺血慢性損傷也有保護(hù)作用。第二部分HAMI3379對(duì)OGD誘導(dǎo)BV2細(xì)胞激活的影響 OGD1h后恢復(fù)(R)48h,可誘導(dǎo)BV2細(xì)胞適度激活,細(xì)胞激活后形態(tài)發(fā)生明顯變化、炎癥因子合成及釋放增加,吞噬功能、細(xì)胞自噬增強(qiáng),細(xì)胞的CysLT1R和CysLT2R表達(dá)上調(diào),并發(fā)生核移位,且兩者表達(dá)在時(shí)空分布變化上具有一致性。HAMI3379可逆轉(zhuǎn)OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞激活,減少炎癥因子的合成和釋放,抑制吞噬功能和細(xì)胞自噬增強(qiáng),抑制CysLT1R和CysLT2R表達(dá)上調(diào)和核移位。普魯司特與HAMI3379作用相似,但對(duì)吞噬功能無(wú)影響。PLA試驗(yàn)證明CysLT1R-CysLT2R間存在相互作用,OGD1h/R48h可增強(qiáng)這種相互作用；HAMI3379可抑制CysLT1R-CysLT2R相互作用,并能增加CysLT1R mRNA表達(dá)。 結(jié)論： (1)在大鼠局灶性腦缺血模型,側(cè)腦室給藥初步證實(shí)HAMI3379對(duì)急性損傷的保護(hù)作用；腹腔注射給藥對(duì)急性、亞急性損傷有保護(hù)作用,并可減輕炎癥反應(yīng),尤其能較強(qiáng)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活,其有效劑量是0.1-0.4mg/kg,治療時(shí)間窗為術(shù)后1h；對(duì)腦缺血慢性損傷亦有保護(hù)作用,促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。其作用與CysLT1R拮抗劑普魯司特相似,但也有不同特點(diǎn)。 (2)在小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株BV2細(xì)胞,HAMI3379可抑制OGD/R誘導(dǎo)BV2細(xì)胞適度激活后的炎癥因子合成及釋放的增加以及吞噬功能、細(xì)胞自噬的增強(qiáng)。普魯司特有相似的作用,但不影響吞噬功能。HAMI3379可抑制OGD/R誘導(dǎo)的CysLT1R-CysLT2R相互作用以及細(xì)胞內(nèi)移動(dòng)變化,且可增強(qiáng)CysLT1R表達(dá)上調(diào)。 (3)首次較系統(tǒng)地證實(shí)CysLT2R拮抗劑抗腦缺血作用,進(jìn)一步證實(shí)了HAMI3379通過(guò)抑制CysLT2R介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活,為其臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2393474