發(fā)布時(shí)間：2018-12-19 07:36

【摘要】：蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyces hepiali)是天然冬蟲夏草中一種重要的內(nèi)生真菌,由于其人工培養(yǎng)物的化學(xué)組成與天然冬蟲夏草具有高度的相似性,使得該菌已成為人工蟲草制品發(fā)酵生產(chǎn)的重要無性型菌株。多年來,天然冬蟲夏草和人工蟲草中多糖類組分的結(jié)構(gòu)和生物活性研究一直深受關(guān)注,但大部分研究均基于天然蟲草或人工蟲草菌絲體多糖,而對(duì)其液體培養(yǎng)過程中釋放到發(fā)酵液中的多糖組分一胞外多糖(Exopolysaccharide)研究較少。相對(duì)于菌絲體中胞內(nèi)多糖,胞外多糖具有產(chǎn)量高、易分離和結(jié)構(gòu)可調(diào)控等優(yōu)點(diǎn),可作為多糖資源開發(fā)的重要來源。為此,本課題對(duì)蝙蝠蛾擬青霉高產(chǎn)胞外多糖液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)所獲得的胞外多糖進(jìn)行了分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定,進(jìn)一步研究了該胞外多糖在腸道菌群調(diào)節(jié)、機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和小鼠酒精肝損傷的保護(hù)等方面的生物活性。主要研究結(jié)果如下：1.蝙蝠蛾擬青霉高產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)影響蝙蝠蛾擬青霉菌絲體生物量和胞外多糖產(chǎn)量的碳氮源、無機(jī)鹽和維生素種類進(jìn)行比較,結(jié)果得出蔗糖、酵母膏、(NH4)2SO4、KH2PO4、 MgSO4·7H2O、CaCl2-2H2O、土豆汁和麥芽汁等8種營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)菌絲體生長(zhǎng)和胞外多糖產(chǎn)生有較好的促進(jìn)作用。在此基礎(chǔ)上,采用部分因子設(shè)計(jì)(FFD)對(duì)其中的顯著性影響因素進(jìn)行了篩選,結(jié)果表明蔗糖、酵母膏、NH4)2SO4和KH2PO44種營(yíng)養(yǎng)因子濃度可以顯著影響菌絲體生物量和胞外多糖綜合收益D-值。為獲得最高的綜合收益D-值,采用中心組合(CCD)對(duì)這四種營(yíng)養(yǎng)因子最佳濃度進(jìn)一步優(yōu)化,得到了蝙蝠蛾擬青霉液體發(fā)酵同時(shí)高產(chǎn)菌絲體和胞外多糖的最佳培養(yǎng)基為：蔗糖46.08g/L,酵母膏4.71 g/L,(NH4)2SO45.72 g/L,KH2PO41.70 g/L,CaCl20.50 g/L, MgSO40.50 g/L,土豆汁1%(v/v)和麥芽汁1%(v/v)。在此條件下,菌絲體生物量和胞外多糖產(chǎn)量分別可達(dá)12.98士0.14 g/L和5.33土0.11 g/L。2.蝙蝠蛾擬青霉胞外多糖的組成、純化、理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)解析比較了不同碳源對(duì)蝙蝠蛾擬青霉液體發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量和胞外多糖產(chǎn)量的影響,結(jié)果表明碳源除了對(duì)它們的產(chǎn)量有顯著影響外,還可以影響多糖片段的理化特性如分子量、單糖組成、糖醛酸含量和蛋白含量等,其中以葡萄糖和甘露糖為碳源可以增加高分子量胞外多糖的比例,而以乳糖為碳源則不能增加多糖中半乳糖的比例。對(duì)以蔗糖為碳源發(fā)酵所獲得的胞外多糖,首先通過膜分離獲得了截留分子量在10kD-1000kD之間組分,然后分別通過DEAE-纖維素陰離子交換層析和Sephdex-G 100凝膠柱層析進(jìn)行分離得到了PHP-1,PHP-2和PHP-3三個(gè)純化組分,分子量分別為1.78×105,2.32×105,1.19×105Da,單糖的摩爾組成分別為：PHP-1 (Man:Rib:Rha: Glc:Gal:Ara=53.62:3.20:3.51:13.10:14.17:2.24),PHP-2 (Man:Rib:Rha:GlcUA:GalUA: Glc:Gal:Ara=55.26:3.05:2.85:0.73:0.58:14.08:15.52:4.47), PHP-3 (Man:Rib:Rha:GlcUA: GalUA:Glc:Gal:Xyl:Ara=25.60:3.78:7.30:6.75:4.43:13.76:30.05:1.35:7.84);通過多種分析方法對(duì)3種多糖組分的化學(xué)組成進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果表明3種多糖分別具有不同的中性糖、糖醛酸、硫酸基及磷酸基含量；經(jīng)紅外光譜、甲基化和核磁分析表明3種多糖的主鏈由→2,6)-a-D-Manp-(1→的甘露聚糖組成,側(cè)鏈出現(xiàn)在→6)-α-D-Manp-(1→的O-2位置,由→2-α-D-Manp-(1→和非還原性末端的α-D-Manp、(β-D-Galp組成。3.蝙蝠蛾擬青霉胞外多糖對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用研究通過體外模擬研究了蝙蝠蛾擬青霉胞外多糖在腸胃液消化過程中的穩(wěn)定性,結(jié)果表明3種胞外多糖在人工胃液和腸液中具有良好的穩(wěn)定性；進(jìn)一步通過體外人糞樣發(fā)酵模型研究了3種胞外多糖在體外發(fā)酵體系中的代謝轉(zhuǎn)變及對(duì)發(fā)酵體系中微生物菌群的影響,結(jié)果表明添加胞外多糖的發(fā)酵體系中,不同菌群能夠較好的實(shí)現(xiàn)菌群間的更替轉(zhuǎn)變,特別是益生菌雙歧桿菌(Bifidobacterium spp.)能夠較好地增殖,對(duì)乳酸菌(LactobacilluslEnterococcus spp.)的生長(zhǎng)也有較好的促進(jìn)作用,雖然擬桿菌(Bacteroides-Prevotella spp.)和梭狀菌(Clostridium coccoides-Eubacterium rectale group)數(shù)量在發(fā)酵初期也有顯著增加,但在發(fā)酵后期可以受到抑制；采用HPLC法對(duì)發(fā)酵進(jìn)程中胞外多糖的代謝以及短鏈脂肪酸和乳酸的產(chǎn)生情況進(jìn)行了監(jiān)測(cè),結(jié)果顯示多糖在發(fā)酵24 h時(shí)絕大部分可被水解,同時(shí)短鏈脂肪酸產(chǎn)量顯著增加,且乙酸與丙酸、丁酸的比例顯著降低,表明該胞外多糖也可以有效調(diào)節(jié)不同短鏈脂肪酸的產(chǎn)生量。4.蝙蝠蛾擬青霉胞外多糖PHP-3的免疫調(diào)節(jié)作用研究采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究了蝙蝠蛾擬青霉胞外多糖PHP-3組分對(duì)脾細(xì)胞的增殖作用和對(duì)巨噬細(xì)胞激活后相關(guān)細(xì)胞因子釋放量的影響。結(jié)果表明PHP-3多糖組分能有效促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖,且與ConA具有一定的協(xié)同作用；與巨噬細(xì)胞的相互作用研究表明PHP-3多糖組分能有效提高巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力,并增加巨噬細(xì)胞免疫效應(yīng)分子NO和細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的釋放量,顯示PHP-3組分在體外具有較好的免疫促進(jìn)功能；采用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠模型試驗(yàn)了PHP-3多糖組分的體內(nèi)免疫促進(jìn)活性。結(jié)果顯示灌胃中、高劑量的PHP-3多糖組分能夠有效拮抗環(huán)磷酰胺引起的小鼠脾臟指數(shù)下降,進(jìn)一步的血清學(xué)檢測(cè)表明灌胃PHP-3多糖組分可顯著提高免疫抑制小鼠血清溶菌酶活性、溶血素水平以及TNF-α、IL-1β的釋放量,顯示了蝙蝠蛾擬青霉胞外多糖PHP-3多糖組分對(duì)免疫抑制小鼠非特異性免疫和特異性免疫能力的促進(jìn)作用。5.蝙蝠蛾擬青霉胞外多糖PHP-1對(duì)小鼠酒精肝損傷的保護(hù)作用研究采用小鼠酒精肝損傷模型評(píng)價(jià)了蝙蝠蛾擬青霉胞外多糖PHP-1組分對(duì)酒精肝損傷小鼠的保護(hù)作用。結(jié)果表明,在灌胃酒精前2h提前灌胃PHP-1多糖溶液對(duì)酒精造成的肝損傷有一定的保護(hù)作用,主要表現(xiàn)為PHP-1中、高劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中AST、 ALT活性、TC含量和小鼠肝臟中MDA水平、TC含量的顯著降低,同時(shí)小鼠肝臟中SOD、 GHS-Px、CAT三種抗氧化酶活力顯著提高；肝臟外部和病理形態(tài)觀察也顯示出小鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積減少、細(xì)胞水腫和組織浸染水平的減輕。
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【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：Q936;R915
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本文編號(hào)：2386613