【摘要】：研究背景肺癌是當(dāng)今世界上癌癥相關(guān)死因中發(fā)生率最高的癌癥種類之一,因此尋找有效的、不良反應(yīng)小的、作用明確以及聯(lián)合用藥治療策略是醫(yī)藥界研究的熱點課題。羧胺三挫(Carboxyamidotriazole,CAI)是本課題組多年來研究的一種毒副作用很低的非細(xì)胞毒類新型抗癌藥,其對體內(nèi)/外多種腫瘤模型有良好的抑制作用,但是CAI在人體臨床試驗中表現(xiàn)的抗腫瘤作用較溫和。為了增強CAI的藥物治療效果以及探索CAI的作用及作用機理,我們開展了三部分的研究:(1)評估CAI與索拉非尼(Sorafenib)協(xié)同抗腫瘤作用,并探討其可能的機制;(2)探索CAI在惡病質(zhì)小鼠中起到的保護性作用;(3)探尋CAI在腫瘤細(xì)胞提升磷酸化乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)作用的上游機制。索拉非尼是一種口服的多激酶抑制劑,可通過抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性,抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增殖。同時可通過抑制PDGF和VEGF受體酪氨酸激酶的活性,而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。索拉非尼可以延長非小細(xì)胞肺癌患者的無進(jìn)展生存期,但是總體療效有限。本部分研究探索CAI與索拉非尼在非小細(xì)胞肺癌中的協(xié)同治療作用以及其發(fā)揮協(xié)同作用可能的機制,旨在為非小細(xì)胞肺癌的臨床治療提供新的方案并提供理論依據(jù)。此外伴隨癌癥產(chǎn)生的癌性惡病質(zhì)是一種以全身性系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)為特征的紊亂綜合癥,它的發(fā)生不僅對患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重的不良影響,還可以使患者對化療藥物反應(yīng)度降低并最終降低生存率。CAI除了具有抗癌特性之外其在多種疾病模型中均體現(xiàn)出良好的抗炎作用�；贑AI的這種抗炎特性,我們同時在此探討CAI對腫瘤進(jìn)展中出現(xiàn)的肌肉萎縮現(xiàn)象是否具有保護與治療作用。我們在本研究中發(fā)現(xiàn)CAI對乙酰輔酶A竣化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)有抑制作用,為了更深入的探討CAI抗腫瘤作用的具體分子機制,在此我們對于引起ACC抑制的上游信號通路進(jìn)行探討。研究方法用SRB法檢測CAI和/或索拉非尼在三株非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中的增殖抑制作用,并計算聯(lián)合用藥指數(shù),并計算CAI對LLC細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。用Annexin V/PI對細(xì)胞進(jìn)行染色,并用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測細(xì)胞凋亡比例。用DCFH-DA對細(xì)胞內(nèi)活性氧進(jìn)行染色并分別用熒光顯微鏡與流式細(xì)胞術(shù)的方法進(jìn)行定性與定量分析。用MitoSox對線粒體特異的超氧化物進(jìn)行染色并用流式細(xì)胞術(shù)檢測。NANOG的mRNA和蛋白表達(dá)水平分別用熒光定量PCR和western blot進(jìn)行分析。堿性成纖維生長因子(bFGF)作為NANOG的刺激劑,在LLC和A549細(xì)胞中與藥物共孵育來考察NANOG在CAI和索拉非尼引起活性氧積累中的作用。使用GSH(ROS的清除劑)或bFGF與藥物共孵育并用流式細(xì)胞術(shù)的方法對細(xì)胞凋亡比例進(jìn)行檢測。建立荷瘤小鼠模型,并評價CAI與索拉非尼在體內(nèi)的抑制腫瘤的作用。建立晚期肺癌移植瘤模型,評估CAI對小鼠去瘤體重的保護作用。使用Western blot和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)對給藥29天后對其腓腸肌中的蛋白和mRNA表達(dá)水平的變化進(jìn)行檢測。用ELISA的方法檢測血清中促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的水平。CAI在體外對SIRT1的直接激活作用通過熒光定量的方法進(jìn)行測定。用western blot方法檢測CAI對磷酸化ACC水平的影響,并通過使用鈣凋蛋白依賴性蛋白激酶激酶β(CaMKKβ)阻滯劑STO609、具有肝激酶B1(Liver kinase B1,LKB1)突變的A549細(xì)胞、SIRT1抑制劑Ex 527和煙酰胺以及PKA抑制劑H-89與CAI共孵育,再檢測磷酸化ACC的水平來判斷上游信號通路對磷酸化ACC的影響。研究結(jié)果1.在非小細(xì)胞肺癌株(LLC、A549和NCI-H1975)中CAI與索拉非尼協(xié)同抑制細(xì)胞增殖。2.CAI與索拉非尼聯(lián)合使用可以提升細(xì)胞凋亡水平以及上調(diào)cleaved-caspase 3和cleaved-PARP的水平。同時使用Z-VAD-FMK(pan-caspase抑制劑)與藥物共孵育可以減少藥物引起的細(xì)胞凋亡水平。3.CAI與索拉非尼合用可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累,同時也提升線粒體特異的超氧化物的產(chǎn)生。4.CAI與索拉非尼合用可降低細(xì)胞中NANOG的mRNA與蛋白表達(dá)水平。在細(xì)胞中使用bFGF,可同時刺激細(xì)胞內(nèi)NANOG的表達(dá)以及刺激細(xì)胞增殖。5.將bFGF與藥物共孵育,可以減輕藥物誘導(dǎo)的活性氧的產(chǎn)生。6.將GSH(活性氧清除劑)或bFGF與藥物進(jìn)行共孵育,可以減緩藥物引發(fā)的細(xì)胞凋亡比例。7.在體內(nèi)試驗中,CAI與索拉非尼(10 mgkg-1)合用可以顯著的抑制腫瘤的生長,這種抑制能力與索拉非尼高劑量單用組(30mgkg-1)相當(dāng)。同時CAI和索拉非尼合用組與索拉非尼高劑量組比較,前者的小鼠去瘤體重更重。8.CAI和索拉非尼合用可以降低小鼠腫瘤組織中的NANOG的蛋白含量,并且可以提升腫瘤組織中的脂質(zhì)過氧化水平。9.在癌性惡病質(zhì)模型鼠中,從接種腫瘤細(xì)胞后第19天開始,CAI給藥組小鼠的去瘤體重與溶劑對照組比表現(xiàn)出顯著升高。實驗結(jié)束時,CAI組小鼠的腓腸肌與附睪脂肪組織的重量比溶劑對照組有顯著性的增加。10.在腓腸肌組織中CAI通過抑制與蛋白水解相關(guān)的Fox03轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)以及泛素連接酶E3(MuRFl和atrogin1)的表達(dá)來抑制肌肉組織的消耗。同時在肌肉組織中CAI表現(xiàn)出上調(diào)IκBα蛋白水平以及下調(diào)磷酸化IKKα/β體現(xiàn)出對NF-κB信號通路有效的抑制。并且CAI下調(diào)血清中的IL-6和TNF-α的含量,也下調(diào)肌肉中的TNF-α的水平。在體外實驗中CAI體現(xiàn)出對SIRT1酶的直接激活作用,在腓腸肌組織中CAI組小鼠的SIRT1蛋白表達(dá)量顯著上升。11.CAI在體外可以劑量依賴的提升細(xì)胞內(nèi)磷酸化ACC的水平。12.CAI的提升磷酸化ACC水平的作用是非依賴CaMKKβ和LKB1的,同時是部分依賴于SIRT1和PKA活力的。研究結(jié)論CAI與索拉非尼在體內(nèi)與體外實驗中均可協(xié)同抑制非小細(xì)胞肺癌的增殖,其可能的機制是抑制細(xì)胞內(nèi)NANOG的表達(dá)進(jìn)而提升線粒體產(chǎn)生的活性氧的累積,并最終誘發(fā)細(xì)胞的凋亡。此外,CAI因其具有對NF-κB的抑制性作用以及對SIRT1的激活作用,則表現(xiàn)出緩解惡病質(zhì)模型中肌肉消耗的現(xiàn)象。最后CAI通過部分依賴SIRT1和PKA而非依賴于CaMKKβ和LKB1的方式抑制ACC的作用。這可能是CAI引起上述細(xì)胞信號通路的作用靶點。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R96

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