發(fā)布時(shí)間：2018-12-13 13:29

【摘要】：研究背景肺癌是當(dāng)今世界上癌癥相關(guān)死因中發(fā)生率最高的癌癥種類之一,因此尋找有效的、不良反應(yīng)小的、作用明確以及聯(lián)合用藥治療策略是醫(yī)藥界研究的熱點(diǎn)課題。羧胺三挫(Carboxyamidotriazole,CAI)是本課題組多年來研究的一種毒副作用很低的非細(xì)胞毒類新型抗癌藥,其對(duì)體內(nèi)/外多種腫瘤模型有良好的抑制作用,但是CAI在人體臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)的抗腫瘤作用較溫和。為了增強(qiáng)CAI的藥物治療效果以及探索CAI的作用及作用機(jī)理,我們開展了三部分的研究:(1)評(píng)估CAI與索拉非尼(Sorafenib)協(xié)同抗腫瘤作用,并探討其可能的機(jī)制;(2)探索CAI在惡病質(zhì)小鼠中起到的保護(hù)性作用;(3)探尋CAI在腫瘤細(xì)胞提升磷酸化乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)作用的上游機(jī)制。索拉非尼是一種口服的多激酶抑制劑,可通過抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性,抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增殖。同時(shí)可通過抑制PDGF和VEGF受體酪氨酸激酶的活性,而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。索拉非尼可以延長(zhǎng)非小細(xì)胞肺癌患者的無進(jìn)展生存期,但是總體療效有限。本部分研究探索CAI與索拉非尼在非小細(xì)胞肺癌中的協(xié)同治療作用以及其發(fā)揮協(xié)同作用可能的機(jī)制,旨在為非小細(xì)胞肺癌的臨床治療提供新的方案并提供理論依據(jù)。此外伴隨癌癥產(chǎn)生的癌性惡病質(zhì)是一種以全身性系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)為特征的紊亂綜合癥,它的發(fā)生不僅對(duì)患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重的不良影響,還可以使患者對(duì)化療藥物反應(yīng)度降低并最終降低生存率。CAI除了具有抗癌特性之外其在多種疾病模型中均體現(xiàn)出良好的抗炎作用�；贑AI的這種抗炎特性,我們同時(shí)在此探討CAI對(duì)腫瘤進(jìn)展中出現(xiàn)的肌肉萎縮現(xiàn)象是否具有保護(hù)與治療作用。我們?cè)诒狙芯恐邪l(fā)現(xiàn)CAI對(duì)乙酰輔酶A竣化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)有抑制作用,為了更深入的探討CAI抗腫瘤作用的具體分子機(jī)制,在此我們對(duì)于引起ACC抑制的上游信號(hào)通路進(jìn)行探討。研究方法用SRB法檢測(cè)CAI和/或索拉非尼在三株非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中的增殖抑制作用,并計(jì)算聯(lián)合用藥指數(shù),并計(jì)算CAI對(duì)LLC細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。用Annexin V/PI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,并用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例。用DCFH-DA對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧進(jìn)行染色并分別用熒光顯微鏡與流式細(xì)胞術(shù)的方法進(jìn)行定性與定量分析。用MitoSox對(duì)線粒體特異的超氧化物進(jìn)行染色并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。NANOG的mRNA和蛋白表達(dá)水平分別用熒光定量PCR和western blot進(jìn)行分析。堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)作為NANOG的刺激劑,在LLC和A549細(xì)胞中與藥物共孵育來考察NANOG在CAI和索拉非尼引起活性氧積累中的作用。使用GSH(ROS的清除劑)或bFGF與藥物共孵育并用流式細(xì)胞術(shù)的方法對(duì)細(xì)胞凋亡比例進(jìn)行檢測(cè)。建立荷瘤小鼠模型,并評(píng)價(jià)CAI與索拉非尼在體內(nèi)的抑制腫瘤的作用。建立晚期肺癌移植瘤模型,評(píng)估CAI對(duì)小鼠去瘤體重的保護(hù)作用。使用Western blot和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)對(duì)給藥29天后對(duì)其腓腸肌中的蛋白和mRNA表達(dá)水平的變化進(jìn)行檢測(cè)。用ELISA的方法檢測(cè)血清中促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的水平。CAI在體外對(duì)SIRT1的直接激活作用通過熒光定量的方法進(jìn)行測(cè)定。用western blot方法檢測(cè)CAI對(duì)磷酸化ACC水平的影響,并通過使用鈣凋蛋白依賴性蛋白激酶激酶β(CaMKKβ)阻滯劑STO609、具有肝激酶B1(Liver kinase B1,LKB1)突變的A549細(xì)胞、SIRT1抑制劑Ex 527和煙酰胺以及PKA抑制劑H-89與CAI共孵育,再檢測(cè)磷酸化ACC的水平來判斷上游信號(hào)通路對(duì)磷酸化ACC的影響。研究結(jié)果1.在非小細(xì)胞肺癌株(LLC、A549和NCI-H1975)中CAI與索拉非尼協(xié)同抑制細(xì)胞增殖。2.CAI與索拉非尼聯(lián)合使用可以提升細(xì)胞凋亡水平以及上調(diào)cleaved-caspase 3和cleaved-PARP的水平。同時(shí)使用Z-VAD-FMK(pan-caspase抑制劑)與藥物共孵育可以減少藥物引起的細(xì)胞凋亡水平。3.CAI與索拉非尼合用可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累,同時(shí)也提升線粒體特異的超氧化物的產(chǎn)生。4.CAI與索拉非尼合用可降低細(xì)胞中NANOG的mRNA與蛋白表達(dá)水平。在細(xì)胞中使用bFGF,可同時(shí)刺激細(xì)胞內(nèi)NANOG的表達(dá)以及刺激細(xì)胞增殖。5.將bFGF與藥物共孵育,可以減輕藥物誘導(dǎo)的活性氧的產(chǎn)生。6.將GSH(活性氧清除劑)或bFGF與藥物進(jìn)行共孵育,可以減緩藥物引發(fā)的細(xì)胞凋亡比例。7.在體內(nèi)試驗(yàn)中,CAI與索拉非尼(10 mgkg-1)合用可以顯著的抑制腫瘤的生長(zhǎng),這種抑制能力與索拉非尼高劑量單用組(30mgkg-1)相當(dāng)。同時(shí)CAI和索拉非尼合用組與索拉非尼高劑量組比較,前者的小鼠去瘤體重更重。8.CAI和索拉非尼合用可以降低小鼠腫瘤組織中的NANOG的蛋白含量,并且可以提升腫瘤組織中的脂質(zhì)過氧化水平。9.在癌性惡病質(zhì)模型鼠中,從接種腫瘤細(xì)胞后第19天開始,CAI給藥組小鼠的去瘤體重與溶劑對(duì)照組比表現(xiàn)出顯著升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),CAI組小鼠的腓腸肌與附睪脂肪組織的重量比溶劑對(duì)照組有顯著性的增加。10.在腓腸肌組織中CAI通過抑制與蛋白水解相關(guān)的Fox03轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)以及泛素連接酶E3(MuRFl和atrogin1)的表達(dá)來抑制肌肉組織的消耗。同時(shí)在肌肉組織中CAI表現(xiàn)出上調(diào)IκBα蛋白水平以及下調(diào)磷酸化IKKα/β體現(xiàn)出對(duì)NF-κB信號(hào)通路有效的抑制。并且CAI下調(diào)血清中的IL-6和TNF-α的含量,也下調(diào)肌肉中的TNF-α的水平。在體外實(shí)驗(yàn)中CAI體現(xiàn)出對(duì)SIRT1酶的直接激活作用,在腓腸肌組織中CAI組小鼠的SIRT1蛋白表達(dá)量顯著上升。11.CAI在體外可以劑量依賴的提升細(xì)胞內(nèi)磷酸化ACC的水平。12.CAI的提升磷酸化ACC水平的作用是非依賴CaMKKβ和LKB1的,同時(shí)是部分依賴于SIRT1和PKA活力的。研究結(jié)論CAI與索拉非尼在體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)中均可協(xié)同抑制非小細(xì)胞肺癌的增殖,其可能的機(jī)制是抑制細(xì)胞內(nèi)NANOG的表達(dá)進(jìn)而提升線粒體產(chǎn)生的活性氧的累積,并最終誘發(fā)細(xì)胞的凋亡。此外,CAI因其具有對(duì)NF-κB的抑制性作用以及對(duì)SIRT1的激活作用,則表現(xiàn)出緩解惡病質(zhì)模型中肌肉消耗的現(xiàn)象。最后CAI通過部分依賴SIRT1和PKA而非依賴于CaMKKβ和LKB1的方式抑制ACC的作用。這可能是CAI引起上述細(xì)胞信號(hào)通路的作用靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2376612