【摘要】：細(xì)菌常以一種群體生活方式來面對(duì)外界不利的生活環(huán)境,它們能夠粘附到生物材料表面或者機(jī)體表面,生長形成致密的生物膜,此類感染能抵御抗生素的治療,和機(jī)體自身免疫系統(tǒng)的清除。表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌是在植入性醫(yī)療材料上引起的生物膜相關(guān)感染的常見病菌。表皮葡萄球菌的致病性雖然比金黃色葡萄球菌要弱,但由于能夠形成厚而致密的生物膜,也已成為院內(nèi)感染的主要條件致病菌。葡萄球菌生物膜引起多重耐藥機(jī)制復(fù)雜,生物膜內(nèi)細(xì)菌的代謝率和生長速率低,對(duì)抗生素的敏感性差；生物膜基質(zhì)能降低抗生素在生物膜內(nèi)的滲透使其中的細(xì)胞減少在抗生素環(huán)境內(nèi)的暴露�，F(xiàn)存的大多數(shù)抗生素都不能有效地穿透生物膜,或者因?qū)Σ牧媳砻娓街痛x率低的細(xì)菌殺傷作用有限而不能有效地應(yīng)對(duì)生物膜相關(guān)感染。研發(fā)新的用于治療葡萄球菌生物膜相關(guān)感染的藥物變得尤為迫切。治療由葡萄球菌引起的生物膜感染有以下幾種策略：調(diào)節(jié)生物膜形成過程中發(fā)揮重要作用的調(diào)控系統(tǒng),如雙組分系統(tǒng),群體感應(yīng)系統(tǒng)；降解生物膜內(nèi)的胞間基質(zhì)以解聚細(xì)菌；開發(fā)新一代的抗生素,抗菌藥物的新聯(lián)合應(yīng)用。細(xì)菌的雙組分系統(tǒng)在細(xì)菌的生長過程中發(fā)揮重要作用,是開發(fā)新的抗菌藥物的理想靶標(biāo)。本研究共分為三章,第一章主要研究噻唑烷酮類化合物Compound 2衍生物抗表皮葡萄球菌活性；第二章主要研究噻唑烷酮類化合物Compound 5衍生物及其抗菌/生物膜活性；第三章對(duì)表皮葡萄球菌組氨酸激酶YycG抑制劑的作用機(jī)制進(jìn)行了初步的研究。在本課題中,我們對(duì)篩選出的新合成的衍生物的細(xì)胞毒性,體內(nèi)抗生物膜活性、對(duì)臨床菌株的抗菌活性進(jìn)行評(píng)估,為開發(fā)出新型抗菌譜廣、毒性低且具有自主產(chǎn)權(quán)的新型的抗葡萄球菌感染藥物奠定基礎(chǔ)。第一章 噻唑烷酮類化合物Compound 2衍生物抗表皮葡萄球菌活性的研究葡萄球菌是醫(yī)院獲得性感染的重要致病菌,并且在臨床病例中有較高的致死率和致殘率。引起院內(nèi)感染的金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌菌株大部分都是耐藥菌株。金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌菌株能夠粘附到生物材料表面或者機(jī)體表面,生長形成致密的生物膜,更是加劇了抗生素的治療的困難。在本實(shí)驗(yàn)室的前期工作中,以YycG組氨酸激酶HATPase_c功能域作為候選抗菌藥物靶點(diǎn),通過高通量虛擬篩選,獲得了小分子抑制劑Compound 2(3-苯基-5-苯亞甲基-2-苯氨基-4-噻唑酮)。其對(duì)表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌活性和抗生物膜形成作用,且與藥靶蛋白具有很好的親和力并可抑制YycG蛋白磷酸化的活性。在先導(dǎo)化合物噻唑酮母核的基礎(chǔ)上,對(duì)其活性基團(tuán)進(jìn)行拼接、增長或縮短碳鏈、生物電子等排、斷裂和開環(huán)等方式,進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化改造,共設(shè)計(jì)合成了衍生物共95個(gè)。通過生物學(xué)實(shí)驗(yàn),檢測(cè)YycG小分子抑制劑改造化合物的活性,篩選出有較強(qiáng)抑菌活性及抗生物膜作用的化合物。評(píng)估了篩選出的6個(gè)衍生物的抗菌活性,包括MIC,殺菌活性,抗生物膜活性,抑制YycG蛋白磷酸化活性,細(xì)胞毒性,在新西蘭白兔皮下表皮葡萄球菌生物膜感染模型中的體內(nèi)活性。第二章噻唑烷酮類化合物Compound 5衍生物篩選及其抗菌/生物膜活性的研究在本部分實(shí)驗(yàn)中我們采用與改造Compound 2相同的思路,通過改變Compound5雙萘手性磷酸催化劑為主要手段,采用較為簡(jiǎn)便有效的合成光學(xué)純的方法,設(shè)計(jì)和合成新的Compound 5衍生物以增強(qiáng)其抗菌活性。設(shè)計(jì)和合成了新的Compound 5衍生物19個(gè),加上前期報(bào)道的20個(gè),共計(jì)合成Compound 5衍生物39個(gè)。通過生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)這些合成的新的Compound 5衍生物的體外抗菌活性進(jìn)行了檢測(cè),從中選取7個(gè)具有良好抑菌殺菌活性的衍生物:H5-23, H5-24,H5-25,H5-32, H5-33,H5-34和H5-35。首先對(duì)噻唑烷酮類化合物Compound 5的結(jié)構(gòu)改造及篩選/作用靶標(biāo)分析及驗(yàn)證,重點(diǎn)對(duì)Compound 5改造過程中的基團(tuán)變化及所獲得的衍生物的抑菌活性,分析其構(gòu)效關(guān)系。然后對(duì)挑選出的噻唑烷酮類化合物Compound 5衍生物的抗菌活性與抗生物膜活性檢測(cè),檢測(cè)了其對(duì)早期生物膜(6 h)和成熟生物膜(24 h)的抑制作用。通過激光共聚焦顯微鏡和掃描電鏡,評(píng)估了該系列衍生物對(duì)生物膜內(nèi)的細(xì)菌的殺傷效果,并將其與其他常用抗生素的聯(lián)合應(yīng)用,評(píng)價(jià)聯(lián)用后是否能夠增強(qiáng)抗菌效果。最后對(duì)噻唑烷酮類化合物Compound 5衍生物耐藥菌株的產(chǎn)生及其可能機(jī)制的探究。通過將表皮葡萄球菌ATCC35984在亞抑菌濃度的衍生物H5-10內(nèi)連續(xù)傳代30次,獲得疑似耐藥菌株,并對(duì)其可能的耐藥機(jī)制進(jìn)行初步的研究。第三章表皮葡萄球菌組氨酸激酶YycG抑制劑的作用機(jī)制細(xì)菌在生長過程中能夠從環(huán)境中獲得各種信號(hào)來調(diào)控自身相關(guān)基因的表達(dá),從而能夠更好的適應(yīng)環(huán)境。細(xì)菌生長和生物膜的形成受到雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(two-component signal transduction systems, TCS)的調(diào)控。雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)作為一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑廣泛存在于原核生物中,主要由組氨酸蛋白激酶和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白兩種蛋白質(zhì)組成,而哺乳動(dòng)物(包括人類)不存在,因此TCS可做為新型抗菌/抗生物膜藥物的靶標(biāo)[1]。研究表明雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)YycG/YycF廣泛存在于革蘭陽性細(xì)菌中(如葡萄球菌、枯草桿菌、鏈球菌等),并與細(xì)菌生長密切相關(guān),為細(xì)菌存活所不可缺少,被認(rèn)為是潛在的藥物靶標(biāo)。其中組氨酸蛋白激酶(如YycG)是跨膜蛋白,當(dāng)外界信號(hào)與其膜外配體結(jié)合后可使其自身磷酸化；而反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(如YycF)是胞質(zhì)蛋白,其調(diào)控區(qū)域能與磷酸化的組氨酸蛋白激酶相互作用,發(fā)生磷酸化后構(gòu)象改變從而暴露相應(yīng)的DNA結(jié)合位點(diǎn),再結(jié)合不同的DNA序列,進(jìn)行一系列的調(diào)控反應(yīng)[2,3]。YycG/YycF對(duì)表皮葡萄球菌生長和生物膜的形成發(fā)揮十分重要的調(diào)控作用,然而其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。在本實(shí)驗(yàn)室的前期工作中,篩選到針對(duì)表皮葡萄球菌YycG/YycF雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中YycG組氨酸激酶的抑制劑,發(fā)現(xiàn)該類抑制劑不僅對(duì)浮游狀態(tài)的表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的殺菌活性,而且可以破壞表皮葡萄球菌形成的生物膜、殺滅包被于生物膜內(nèi)的細(xì)菌[4-6]。本部分課題一方面根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的YycG/YycF可能調(diào)控的與葡萄球菌生長和生物膜形成相關(guān)的下游基因,通過使用YycG抑制劑(Compound 2衍生物H2-81)檢測(cè)其對(duì)表皮葡萄球菌YycGF系統(tǒng)下游基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。另一方面用實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建yycG和yycF沉默表達(dá)載體,對(duì)YycG和YycF進(jìn)行沉默,觀察沉默后表皮葡萄球菌表型和下游基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。以期能驗(yàn)證小分子抑制劑對(duì)作用機(jī)制進(jìn)行說明,為闡明YycG/YycF對(duì)細(xì)菌生長和生物膜形成的調(diào)控機(jī)制奠定一定的基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R96
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本文編號(hào)：2344668