【摘要】：血小板減少癥(Thrombocytopenia)是臨床上的常見病和多發(fā)病,腫瘤的放療、化療,骨髓移植及慢性肝臟疾病都能誘導產(chǎn)生血小板減少癥。當血小板數(shù)目降低至20,000/mm3時,就需要進行血小板輸注,但血小板的污染及抗體的形成都會影響輸血的效果。臨床上常用血小板濾器或選擇與HLA相同的血小板以減少抗血小板抗體的形成。目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)許多細胞因子可以促進血小板的生成,如干細胞因子(SCF)、白介素-1(IL-1)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)、白介素-11(IL-11)、白介素-3(IL-3)與粒細胞集落刺激生物因子(GM-CSF)的融合蛋白PIXY-321,促血小板生成素(TPO)都開始用于治療放化療導致的血小板減少癥。這些細胞因子在前期的臨床實驗中均表現(xiàn)出刺激巨核細胞增殖及促進血小板生成的作用,但在臨床試驗中,它們的療效并不盡如人意,出現(xiàn)了很多嚴重的毒副作用。因而尋找一種更安全有效地提升血小板的藥物具有極為重要的意義。許多氨酰tRNA合成酶具有細胞因子功能,其中人酪氨酰tRNA合成酶第341位氨基酸發(fā)生突變后具有促進血小板生成的功能。本研究為了證明第341位氨基酸發(fā)生突變的重組人酪氨酰tRNA合成酶(rhTyrRS)突變體具有治療化療后血小板減少癥的作用,將通過三個部分進行實驗：一、rhTyrRS (Y341A)的藥效學和急性毒性研究。建立小鼠血小板減少模型,通過腹腔注射給藥并定期檢測小鼠血小板,解剖小鼠后對各組織臟器進行HE染色及觀察巨核細胞情況；二、rhTyrRS(Y341A)的作用機理與信號通路。通過M07-e細胞的遷移實驗和THP-1與HUVEC細胞的黏附實驗分析rhTyrRS (Y341A)促血小板生成的機理。通過免疫熒光實驗分析rhTyrRS (Y341A)與和NFκB信號通路的關(guān)系。三、rhTyrRS (Y341A)的中試研究。通過中試發(fā)酵并純化得到大量具有生物活性的蛋白,經(jīng)過一系列質(zhì)量檢定和驗證后,制成注射用粉針劑；一、rhTyrRS (Y341A)的藥效學和急性毒性研究小鼠連續(xù)7天腹腔注射1μg/kg,10μg/kg,100μg/kg劑量的rhTyrRS(Y341A),以5μg/kg TPO為陽性對照,PBS為陰性對照,生理鹽水為空白對照,定期剪尾取血分析血小板數(shù)目變化。實驗第8天通過皮下注射環(huán)磷酰胺誘導血小板減少癥,持續(xù)取血分析血小板數(shù)目變化。最后將小鼠解剖后對各臟器進行HE染色觀察,用免疫組織化學方法檢測巨核細胞在骨髓中的分布。結(jié)果顯示連續(xù)7天注射rhTyrRS (Y341A)后逐漸提升了血小板數(shù)目,不同劑量的rhTyrRS (Y341A)對血小板提升呈明顯的量效關(guān)系。注射rhTyrRS (Y341A)大大降低了環(huán)磷酰胺對肝臟等臟器的毒性,降低了血小板減少癥的程度及幅度,促進了巨核細胞在血竇附近的聚集并提高了血竇周圍巨核細胞占總巨核細胞數(shù)目的比例。通過一次大劑量給藥方式檢測rhTyrRS (Y341A)的急性毒性,結(jié)果顯示一次注射rhTyrRS (Y341A) (22mg/kg),小鼠未出現(xiàn)死亡,各臟器未見毒副作用。本章中我們初步發(fā)現(xiàn)rhTyrRS(Y341A)可用于治療化療引起的血小板減少癥,其升血小板作用具有量效和時效關(guān)系。二、rhTyrRS (Y341A)的作用機理與信號通路根據(jù)第一章中rhTyrRS (Y341A)促進了巨核細胞在血竇附近的聚集并提高了血竇周圍巨核細胞占總巨核細胞數(shù)目的比例的結(jié)果,我們采用M07-e細胞的transwell遷移實驗和THP-1和HUVEC細胞的黏附實驗分析rhTyrRS (Y341A)具有的促細胞遷移和黏附作用。通過RT-PCR,定量PCR和流式細胞方法證明HUVEC細胞表面的VCAM-1是細胞黏附過程中的關(guān)鍵因子。再通過免疫熒光實驗探索VCAM-1表達相關(guān)的信號通路。實驗結(jié)果表明rhTyrRS (Y341A)促進了M07-e細胞的遷移和THP-1與HUVEC細胞的黏附。其遷移和黏附作用與rhTyrRS (Y341A)的量具有一定的量效關(guān)系,呈鐘形曲線分布并以10nnM為頂峰。定量PCR和流式細胞實驗表明rhTyrRS促進了HUVEC細胞表面VCAM-1的表達。免疫熒光細胞實驗表明rhTyrRS促進了NFκB的入核。在本章中我們發(fā)現(xiàn)rhTyrRS (Y341A)可能通過刺激NFκB信號通路來促進巨核細胞的遷移和黏附從而提升血小板。三、rhTyrRS (Y341A)的中試研究為了得到大量具有生物活性的rhTyrRS (Y341A)用于后續(xù)藥代動力學和藥理毒理研究,在實驗室搖瓶表達及5L發(fā)酵罐優(yōu)化的基礎(chǔ)上,采用30L NBS發(fā)酵罐研究發(fā)酵工藝的最適參數(shù)。大腸桿菌經(jīng)18小時發(fā)酵后離心收集菌體。緩沖液重懸后高壓破菌并收集上清,經(jīng)過陽離子交換層析,凝膠過濾層析,陰離子交換層析后得到純化的rhTyrRS,經(jīng)SDS-PAGE、Western-Blot、N端測序、LC/MS、HPLC、內(nèi)毒素檢測和氨�；钚詸z測等鑒定后,以甘露醇為輔劑,制成注射用粉針劑。純化后得到的5g的rhTyrRS(Y341A),蛋白回收率大于25%,產(chǎn)率大于250 mg/L。純化后的rhTyrRS (Y341A)的N端前15個氨基酸與理論序列一致,蛋白純度大于95%, LC/MS計算分子量為59.18KDa,與理論分子量一致。氨酰化活性實驗和ELISA實驗證明rhTyrRS (Y341A)具有蛋白活性和細胞因子活性。在本章中,我們初步建立了注射用rhTyrRS (Y341A)的生產(chǎn)和檢定規(guī)程,中試工藝較穩(wěn)定,可線性放大以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R943;R965

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 趙明煒,王恩多;兩種具有調(diào)節(jié)血管生成作用的氨基酰-tRNA合成酶[J];生物化學與生物物理進展;2003年05期

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本文編號：2337421