【摘要】：多肽類(lèi)HIV融合抑制劑——T20(藥品通用名：恩夫韋肽)已用于臨床治療艾滋病,但由于該多肽藥物半衰期短、藥效低、生產(chǎn)成本高,從而限制了其臨床應(yīng)用。近年來(lái),一系列更高效率的多肽類(lèi)HIV融合抑制劑,如T1144,被開(kāi)發(fā)出來(lái),然而其半衰期相對(duì)較短和生產(chǎn)成本高的缺點(diǎn)仍然是制約多肽HIV融合抑制劑藥物發(fā)展的瓶頸。如何設(shè)計(jì)長(zhǎng)效且生產(chǎn)成本比多肽藥物低的非多肽HIV融合抑制劑成為未來(lái)HIV融合抑制劑研發(fā)領(lǐng)域的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。本研究設(shè)計(jì)出一個(gè)長(zhǎng)效的蛋白類(lèi)HIV融合抑制劑一一FLT (FN3-L35-T1144)。FLT是由三個(gè)蛋白片段(或多肽)組成,即FN3、L35和T1144。FN3為具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的擬抗體,其分子量小,可以與人血清白蛋白(Human Serum Albumin)發(fā)生可逆性結(jié)合,從而達(dá)到延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期的作用。T1144為第三代多肽類(lèi)HIV融合抑制劑,具有比T20更高效的抗HIV-1病毒活性。L35是由35個(gè)氨基酸構(gòu)成的連接肽,它把FN3和T1144連接在一起形成一個(gè)新的蛋白類(lèi)HIV融合抑制劑——FLT (FN3-L35-T1144)。我們的試驗(yàn)結(jié)果證明FLT具有高效、廣譜的抗HIV-1活性,在體內(nèi)的半衰期明顯延長(zhǎng)。此外,FLT重組蛋白可以在大腸桿菌(原核系統(tǒng))中大量可溶性地表達(dá),大大降低了HIV融合抑制劑藥物生產(chǎn)成本。因此,使用擬抗體技術(shù)可顯著延長(zhǎng)HIV融合抑制劑的半衰期,降低藥物的生產(chǎn)及治療成本,為解決多肽藥物的開(kāi)發(fā)瓶頸提供新的解決方法。本研究主要圍繞HIV融合抑制劑的長(zhǎng)效性研究展開(kāi),主要結(jié)論如下：以pPBHFT-Fn3-FG和PGEX-6P-1MD1.1-L35-T1144質(zhì)粒為模板,成功構(gòu)建了重組蛋白FLT。目的蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中可獲得大量表達(dá)(絕大部分以上清表達(dá)為主,不溶的包涵體形式很少)。通過(guò)連接擬抗體FN3結(jié)構(gòu)域,可以促進(jìn)高度疏水序列T1144的原核表達(dá)產(chǎn)量。擬抗體FN3結(jié)構(gòu)域利用其自身的高表達(dá)性,作為分子伴侶促進(jìn)了T1144的折疊。每升大腸桿菌中,約可獲得重組蛋白20 mg以上,成功解決了含多疏水性氨基酸序列蛋白的表達(dá)問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因重組技術(shù)將不同功能的多肽連接,同時(shí)設(shè)計(jì)了一段富含親水性的氨基酸的小分子多肽連接序列—-L35 (G-G-G-G-S)7作為柔性序列,最大程度上解決空間位阻問(wèn)題,從而得到具有雙功能的重組蛋白FLT。在HIV-1 ⅢB和Bal病毒抑制實(shí)驗(yàn)中,FLT均在低納摩爾級(jí)表現(xiàn)出病毒抑制能力,其IC50值分別為11.39 nM和14.90 nM。重組蛋白FLT對(duì)臨床病毒株同樣表現(xiàn)出很強(qiáng)的病毒抑制能力。HIV-1融合抑制劑的主要作用機(jī)制是抑制病毒與靶細(xì)胞膜的融合,而HIV-1表面膜蛋白gp41六螺旋核心束的形成是gp41介導(dǎo)膜融合過(guò)程中的關(guān)鍵步驟。通過(guò)六螺旋競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)和熒光非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(FN-PAGE)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)重組蛋白FLT發(fā)揮高效抗病毒作用的機(jī)制是干擾gp41的NHR和CHR形成六螺旋核心束。采用等溫滴定量熱技術(shù)(ITC)和表面等離子共振技術(shù)(SPR)檢測(cè)重組蛋白FLT在體外與人血清白蛋白的結(jié)合情況,得到重組蛋白FLT與人血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)Ka為2.50×106,結(jié)合比為2.711。本實(shí)驗(yàn)采用雙抗夾心ELISA法對(duì)FLT重組蛋白、T1144多肽及T20多肽進(jìn)行定量檢測(cè)。藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究表明,單次尾靜脈注射FLT蛋白后血清藥物濃度消除呈非線(xiàn)性消除。T20多肽的半衰期約為1.22±0.2 h,T1144多肽的半衰期約為7.48±0.4 h,FLT重組蛋白的半衰期可達(dá)27.10±6.9 h,達(dá)到T20多肽半衰期的22.19倍,T1144多肽半衰期的3.62倍。注射FLT蛋白、T1144多肽和T20多肽后,不同時(shí)間點(diǎn)的血清樣本對(duì)HIV-1病毒抑制效果呈現(xiàn)出與體內(nèi)藥物濃度相同趨勢(shì)變化。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)對(duì)下一代雙功能HIV融合抑制劑2DLT與抗艾滋病藥物的協(xié)同作用進(jìn)行研究,證實(shí)2DLT可以與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物組合使用具有互補(bǔ)和協(xié)同效應(yīng),表明2DLT可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成一個(gè)新的蛋白類(lèi)抗HIV藥物,可與其他抗HIV藥物聯(lián)用來(lái)治療那些已對(duì)現(xiàn)有的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物產(chǎn)生高度耐受性的艾滋病人。
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【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R91

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2 葉劍雄,紀(jì)曉峰,王薇薇,何巋,葛忠良,郝崇;重組人血清白蛋白的表達(dá)[J];上海醫(yī)藥;2000年11期

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本文編號(hào)：2328565