【摘要】：腫瘤免疫治療是一種新的腫瘤治療手段,在預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、治療腫瘤病灶等方面有其獨特的優(yōu)勢。DNA疫苗是很有發(fā)展前景的腫瘤治療性疫苗,但常規(guī)的質(zhì)粒DNA注射給藥免疫效應(yīng)不夠理想,而且存在潛在的安全問題。研制具有強大免疫應(yīng)答的DNA抗腫瘤疫苗給藥系統(tǒng)與新型給藥方法是藥劑學(xué)研究人員面臨的一個重大課題。為此,本研究針對現(xiàn)有DNA抗腫瘤疫苗轉(zhuǎn)染率低,免疫性能不強等問題,利用樹突狀細胞膜表面的受體,設(shè)計兩種新型的非病毒型納米載體材料——甘露糖基化高分子PEI (PEI25k-Man)和甘露糖基化低分子PEI共價連接細胞穿膜肽CPP (CPP-PEI1800-Man).本研究以惡性程度高、目前各種治療方法極不敏感的惡性黑色素瘤為抗腫瘤治療模型,構(gòu)建黑色素瘤特異腫瘤抗原(Trp2)、細胞因子(GM-CSF)、Fc融合蛋白3種基因表達單位元件,以構(gòu)成一種多元、靶向、高效的復(fù)合型DNA疫苗為模型藥物。進一步通過理化性能和生物學(xué)手段評價載體的細胞轉(zhuǎn)染效率、體外靶向性以及對原代培養(yǎng)的樹突狀細胞(DC)的刺激、分化、成熟的實驗研究,借助微針陣列技術(shù)考察這兩種納米載體材料介導(dǎo)DNA疫苗復(fù)合物的體內(nèi)靶向性、小鼠抗黑色素瘤治療及抗腫瘤預(yù)防免疫治療效果。 首先通過PEI結(jié)構(gòu)中的伯氨與MPITC結(jié)構(gòu)中的異氰酸酯一步縮合得到甘露糖基化的高分子聚乙烯亞胺(PEI25k-Man)和甘露糖基化的低分子聚乙烯亞胺(PEI1800-Man),再通過異型雙功能交聯(lián)劑SPDP分別與PEI18oo的伯氨和CPP的巰基進行反應(yīng),將兩者結(jié)合在一起形合成CPP-PEI25k-Man。用IR和1H-NMR表征了所合成的兩種陽離子聚合物載體材料。用MTT法考察了所合成的graft-PEI的細胞毒性,發(fā)現(xiàn)在相同作用時間、相同量的PEI及graft-PEI條件下,PEI25k-Man和CPP-PEI1800-Man對細胞的毒性均明顯小于PEI25k的細胞毒性。 通過PCR,成功擴增獲得了黑色素瘤特異腫瘤抗原(Trp2)、GM-CSF和Fc目的基因片段,并將目的基因片段克隆到pUCm-T上,分別得到了Trp2-T質(zhì)粒、GM-CSF-T質(zhì)粒和Fc-T質(zhì)粒。再從Trp2-T質(zhì)粒、GM-CSF-T質(zhì)粒和Fc-T質(zhì)粒上分別進行BglⅡ、SaiⅠ雙酶切和SaiⅠ、BamHI雙酶切得到Trp2、GM-CSF、Fc基因,連接到pEGFP-N2載體上。由酶切鑒定和基因測序可知已成功構(gòu)建了pEGFP-Trp2-GM-CSF-Fc多元質(zhì)粒。 對PEI25k-Man、CPP-PEI1800-Man分別進行理化性質(zhì)考察,包括體外降解能力、縮合DNA能力、與DNA形成納米復(fù)合物后的形態(tài)、粒徑、電位及抗酶解和抗解離能力等性質(zhì)。結(jié)果表明,graft-PEI/DNA納米復(fù)合物的粒徑大多都在80nm-250nm范圍內(nèi),且各納米復(fù)合物的粒徑分布都比較窄(PDI0.25),符合用于體內(nèi)外轉(zhuǎn)染實驗的納米復(fù)合物粒徑范圍；當(dāng)N/P10, graft-PEI/DNA納米復(fù)合物的Zeta電位值都大于20mV,但與相同N/P的PEI25k/DNA納米復(fù)合物的Zeta電位值都有所降低；通過TEM和AFM觀察,graft-PEI/DNA納米復(fù)合物均成類球形；凝膠電泳阻滯實驗證明,一定的N/P值以上,graft-PEI陽離子聚合物均有壓縮、包裹DNA的作用,并具有抗DNase I酶和血清的作用。 針對graft-PEI/DNA納米復(fù)合物的對不同細胞毒性、細胞攝取、細胞轉(zhuǎn)染,以闡明該兩種陽離子聚合物作為基因載體的可行性,通過graft-PEI/DNA納米復(fù)合物在不同細胞的攝取和轉(zhuǎn)染實驗以確定其體外對樹突狀細胞的靶向性；并對原代培養(yǎng)的人臍帶血樹突狀細胞刺激、分化、成熟的實驗研究。MTT結(jié)果顯示,在DC2.4、B16、Hela三種細胞中g(shù)raft-PEI/DNA納米復(fù)合物的細胞毒性均明顯低于PEI25k/DNA納米復(fù)合物,特別是當(dāng)N/P比大于10以后,各組細胞毒性都存在明顯差異,其結(jié)果與單純的聚合物細胞毒性結(jié)果相似。在該三種細胞中,相同N/P比例的graft-PEI/DNA復(fù)合物對DC2.4細胞毒性最大。通過共聚焦熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測,都證明graft-PEI/DNA納米復(fù)合物在DC2.4細胞中的細胞攝取率明顯高于PEI25k/DNA納米復(fù)合物,且培養(yǎng)基中甘露糖的存在影響graft-PEI/DNA納米復(fù)合物在DC2.4細胞攝取率,但PEI25k/DNA納米復(fù)合物對此幾乎無影響。通過共聚焦熒光顯微鏡觀察到,納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染DC2.4細胞48h后,細胞內(nèi)綠熒光蛋白瞬時表達量是graft-PEI/DNA明顯高于PEI25k/DNA納米復(fù)合物。graft-PEI/DNA納米復(fù)合物對DC2.4細胞和Hela細胞的攝取實驗以及細胞轉(zhuǎn)染實驗的結(jié)果都證明graft-PEI/DNA納米復(fù)合物具有體外DC靶向性。graft-PEI/DNA納米復(fù)合物能刺激原代培養(yǎng)DC細胞表達表面共刺激因子。并使促使DC細胞分泌IFN-y和IL-12p70等細胞因子,與PEI25k/DNA組相比存在有顯著性差異(P0.01)。 在微針作用下,graft-PEI納米復(fù)合物在離體皮膚中的分布情況及體內(nèi)靶向性研究。用激光共聚焦顯微鏡觀察得到,微針作用于離體或在體皮膚,graft-PEI/DNA納米復(fù)合物在皮膚活性表皮層的量明顯大于PE125k納米復(fù)合物。并且發(fā)現(xiàn)不同嫁接率的PEI25k介導(dǎo)QD在活性表皮層的量存在明顯差異。在體外透皮擴散實驗中,發(fā)現(xiàn)微針作用下,在預(yù)定時間內(nèi),納米復(fù)合物無法透過皮膚層進入接受池中,且發(fā)現(xiàn)體外擴散后,graft-PEI/DNA納米復(fù)合物在皮膚活性表皮層的量明顯大于PEI25k納米復(fù)合物。微針作用后48h, PEI25k-Man、CPP-PEI1800-Man組表皮層滯留量約為PEI25k增加2倍,在真皮層滯留量增加1.5倍。用流式細胞儀檢測,在體小鼠微針給藥后,graft-PEI/pEGFP-N2納米復(fù)合物組的脾淋巴細胞中在CD11c陽性細胞中綠熒光蛋白表達量明顯高于對照組PEI25k/pEGFP-N2,證明了graft-PEI/pEGFP-N2納米復(fù)合物具有脾淋巴細胞靶向性。用活體熒光成像系統(tǒng)分析了graft-PEI/DNA納米復(fù)合物在體內(nèi)的淋巴靶向性。 已構(gòu)建的真核表達EGFP-Trp2-GM-CSF-Fc質(zhì)粒與甘露糖基化修飾的graft-PEI/DNA形成納米混懸液,作為腫瘤DNA疫苗,在微針的作用下對實驗小鼠進行免疫接種,觀察在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答能力及抑制腫瘤效應(yīng)。用ELISA檢測免疫3次后小鼠脾淋巴細胞上清液IL-12、IFN-y的水平,發(fā)現(xiàn)PEI25k-Man/DNA和CPP-PEI1800-Man/DNA免疫組的淋巴細胞上清液中IFN-y濃度相對與裸DNA、PEI25k/DNA對照組水平明顯提高。PEI25k-Man/DNA和CPP-PEI1800-Man/DNA免疫組的脾淋巴細胞上清液中IL-12與裸]DNA、PEI25k/DNA對照組相比,水平明顯提高(P0.01)。微針抗腫瘤預(yù)防免疫三次后,預(yù)先由PEI25k-Man/DNA和CPP-PEI1800-Man/DNA免疫過的小鼠腫瘤生長明顯比PBS組緩慢,而PEI25k-Man/DNA免疫組小鼠腫瘤生長和CPP-PEI1800-Man/DNA免疫組沒有明顯差異�？梢�,PEI25k-Man/DNA和CPP-PEI1800-Man/DNA具有預(yù)防黑色素瘤生長的作用。這兩組小鼠到100d后約90%還是成活的,而PBS組小鼠不到待接種腫瘤后50d內(nèi)已全部死亡,PEI25k/DNA組到70d都死亡。微針抗腫瘤免疫治療3次后,第7d,各組小鼠腫瘤體積無統(tǒng)計學(xué)差異,第14d及21d, PBS組腫瘤體積明顯大于PEI25k-Man/DNA和CPP-PEI1800-Man/DNA組,PEI25k-Man/DNA和CPP-PEI1800-Man/DNA組小鼠腫瘤體積無統(tǒng)計學(xué)差異,第28d開始,PEI25k-Man/DNA和CPP-PEI1800-Man/DNA組小鼠腫瘤體積明顯小于PBS組,且與PEI25k/DNA組小鼠腫瘤大小也具有統(tǒng)計學(xué)差異,說明PEI25k-Man和CPP-PEI1800-Man兩種載體介導(dǎo)的EGFP-Trp2-GM-CSF-Fc質(zhì)粒形成的納米疫苗能夠顯著抑制黑色素瘤生長。且PEI25k-Man/DNA和CPP-PEI1800-Man/DNA兩組小鼠到100d后約70%以上還成活的,而PBS組不到45d已全部死亡,PEI25k/DNA組到60d都死亡。腫瘤組織常規(guī)石蠟切片HE染色,顯微鏡下觀察CPP-PEI1800-Man/DNA組和PEI25k-Man/DNA治療組腫瘤壞死較明顯,在瘤體周圍和瘤體內(nèi)有大量炎性細胞浸潤,PEI25k/DNA組也可見部分腫瘤壞死和炎性細胞浸潤,但明顯要少于CPP-PEI1800-Man/DNA組和PEI25k-Man/DNA治療組。PBS組在顯微鏡下幾乎無腫瘤壞死和炎性細胞浸潤。用免疫組化法檢測CPP-PEI1800-Man/DNA和PEI25k-Man/DNA兩組均有CD8+T淋巴細胞浸潤,其中CPP-PEI1800-Man/DNA組最多,其次為PEI25k-Man/DNA組,PEI25k/DNA組出現(xiàn)少量呈棕褐色的細胞核,PBS組幾乎未見CD8+T淋巴細胞浸潤。 綜上所有研究結(jié)果,表明我們已經(jīng)成功合成PEI25k-Man和CPP-PEI1800-Man兩種陽離子聚合物載體材料,它們具有相對較低的細胞毒性。成功構(gòu)建了包含有黑色素瘤特異腫瘤抗原(Trp2)、細胞因子(GM-CSF)、Fc融合蛋白3種基因表達單位元件pEGFP-Trp2-GM-CSF-Fc質(zhì)粒。graft-PEI/DNA納米復(fù)合物對樹突狀細胞的體外細胞靶向性；能刺激原代培養(yǎng)的人臍帶血樹突狀細胞、分化、成熟,并分泌相關(guān)細胞因子。體內(nèi)免疫預(yù)防及抗腫瘤治療實驗證明在微針介導(dǎo)下,graft-PEI/pEGFP-Trp2-GM-CSF-Fc納米復(fù)合物對黑色素瘤的預(yù)防和抗腫瘤治療具有很好的應(yīng)用潛力。 本文成功地設(shè)計了新型的多重靶向于樹突狀細胞的DNA疫苗納米粒給藥系統(tǒng),探索了DNA疫苗接種新途徑,為新型經(jīng)皮疫苗給藥系統(tǒng)的設(shè)計和安全使用提供依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R94

【參考文獻】

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1 吳小金;陳芳;陸滟霞;楊慧;彭t犂，

本文編號：2328546