【摘要】：目的以殼聚糖(chitosan,CH)為基礎(chǔ),合成具有pH敏感性的兩親性聚合物cRGD-羧甲基殼聚糖-軟脂酸(cRGD modified palmitic acid-carboxymethyl chitosan,cRGD-CMCH-PA),并以其為載體,包載模型藥物紫杉醇(paclitaxel,PTX),制備cRGD修飾的羧甲基殼聚糖軟脂酸載紫杉醇膠束(cRGD-CMCH-PA/PTX),利用cRGD的靶向作用和載體材料的pH敏感性,提高抗腫瘤效果。方法(1)通過親電取代反應(yīng)使殼聚糖羧甲基化,以酰胺基化反應(yīng)接枝軟脂酸和cRGD,合成CMCH-PA和cRGD-CMCH-PA。(2)通過FT-IR、1H-NMR對聚合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,以芘熒光探針法測定其在不同pH的PBS溶液中的臨界膠束濃度(Critical micellar concentration,CMC);薄膜分散法制備空白膠束,測定其在不同pH下的粒徑和電位。(3)通過MTT實驗和溶血性試驗對載體的安全性進(jìn)行了初步評價。(4)制備載藥膠束cRGD-CMCH-PA/PTX。以包封率和載藥量為評價指標(biāo),篩選最佳藥載比,并通過考察cRGD-CMCH-PA/PTX的粒徑分布、Zeta電位及膠束形態(tài)結(jié)構(gòu)等對其質(zhì)量進(jìn)行評價;考察c RGD-CMCH-PA/PTX和Taxol#174;在不同pH環(huán)境中的體外釋放情況。(5)以人源性非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞Luc-A549為體外細(xì)胞模型,采用MTT法考察的cRGD-CMCH-PA/PTX和Taxol#174;細(xì)胞毒性;分別通過共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀及活細(xì)胞工作站定性、定量地考察Luc-A549細(xì)胞對熒光染料香豆素6(Coumarin6)標(biāo)記cRGD-CMCH-PA/C6膠束的攝取情況;流式細(xì)胞儀考察PTX的不同劑型對細(xì)胞凋亡的影響。(6)建立生物自發(fā)光的皮下和原位腫瘤模型,通過生物發(fā)光檢測腫瘤所在位置和生長情況;利用近紅外小動物成像系統(tǒng)(IVIS),分別考察載熒光染料Dir膠束CMCH-PA/Dir和cRGD-CMCH-PA/Dir在接種皮下瘤和原位瘤的荷瘤小鼠體內(nèi)的靶向性。(7)通過正電子發(fā)射斷層顯像/X線計算機(jī)體層成像儀(PET/CT)和生物發(fā)光綜合考察cRGD-CMCH-PA/PTX的體內(nèi)抗腫瘤藥效學(xué)。結(jié)果(1)紅外光譜和1H-NMR譜表征結(jié)果均表明cRGD-CMCH-PA的成功合成,PA和cRGD的接枝率分別為15.0%和37.5%。(2)芘熒光探針法測得cRGD-CMCH-PA在pH 7.4條件下的CMC值為2.72×10-3 mg/ml,而在pH 5.3時的CMC值為1.40×10-2 mg/ml;空白膠束cRGD-CMCH-PA在pH 7.4時的粒徑為(162.9±1.5)nm,Zeta電位為(-17.2±1.6)mV,呈負(fù)電性,而在pH 5.3條件下的粒徑出現(xiàn)多峰,Zeta電位明顯上升,約為(5.4±1.2)mV;MTT試驗和溶血性試驗結(jié)果顯示,所構(gòu)建的膠束具有良好的安全性。(3)對cRGD-CMCH-PA/PTX制備處方進(jìn)行初步篩選,得到載體cRGD-CMCH-PA和藥物PTX最佳質(zhì)量比為10:4(w/w),最佳處方制得膠束的粒徑(162.9±1.5)nm,Zeta電位為(-11.4±0.3)mV,形態(tài)圓整,分布均一;體外釋放實驗顯示Taxol#174;的釋放行為不受pH變化影響,而cRGD-CMCH-PA/PTX在酸性環(huán)境下釋放更為迅速,且累計釋放量增加。(4)MTT試驗結(jié)果表明與Taxol#174;相比,cRGD-CMCH-PA/PTX的IC50值更小,對A549細(xì)胞具有更高的細(xì)胞毒性,且呈現(xiàn)劑量依賴性特點;共聚焦試驗表明細(xì)胞攝取隨著時間延長而增加,且與溶酶體有一定的共定位,cRGD修飾使得膠束更快容易被細(xì)胞攝取,且攝取量增大,流式細(xì)胞儀和活細(xì)胞工作站觀察攝取結(jié)果相符。細(xì)胞凋亡試驗表明PTX制成納米劑型以后,誘導(dǎo)凋亡能力增強(qiáng),且在經(jīng)cRGD修飾后進(jìn)一步增強(qiáng)。(5)體內(nèi)靶向性試驗結(jié)果顯示了cRGD-CMCH-PA/DiR對于皮下腫瘤與原位腫瘤具有較好的腫瘤靶向性。(6)體內(nèi)藥效學(xué)試驗中,生物發(fā)光與18F-FDG攝取情況均表明皮下腫瘤和原位腫瘤生長受到抑制,且cRGD-CMCH-PA/PTX藥效好于CMCH-PA/PTX。結(jié)論成功合成了具有pH敏感和主動靶向功能的兩親性聚合物材料cRGD-CMCH-PA,以該材料所制備的載PTX膠束具有良好的體內(nèi)靶向性和抗腫瘤效果。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R943;R96

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本文編號：2323696