【摘要】：蛋白激酶在多種疾病，，特別是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，以其為藥物靶點的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors， TKIs）則成為近年藥物研發(fā)的熱點。已上市藥物已經(jīng)在多種腫瘤的治療中顯示出其較傳統(tǒng)治療藥物的優(yōu)越性，部分已成為治療腫瘤的一線用藥。但是隨著這些藥物的應(yīng)用，其不良反應(yīng)也逐漸暴露出來，其中較為嚴重的是心臟毒性。TKIs引起的心臟毒性主要表現(xiàn)為慢性充血性心力衰竭[12,17,38,45,46],一經(jīng)發(fā)生，對患者健康將造成嚴重影響。因此，研究TKIs導(dǎo)致的心臟毒性機制及其有效對抗藥物顯得尤為重要。 臨床已經(jīng)報道具有心臟毒性的TKIs藥物有伊馬替尼，蘇尼替尼，尼羅替尼，達沙替尼等，實驗研究顯示，在離體培養(yǎng)心肌細胞和整體動物模型上，伊馬替尼（Imatinib，IM）和蘇尼替尼（sunitinib，SU）均可導(dǎo)致明顯線粒體功能異常[21,22]，目前引起上述線粒體損傷的細胞內(nèi)分子機制尚不清楚，有實驗表明伊馬替尼會誘導(dǎo)離體培養(yǎng)的新生大鼠心室肌細胞（NRVMs）中PKCδ表達水平明顯增加[12]。已知蛋白激酶C（proteinkinase C, PKC）是一類絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，在跨膜信號傳遞過程中起重要作用，能夠調(diào)節(jié)細胞的代謝、生長、增殖和分化等。迄今，已鑒定出至少10種PKC亞型（異構(gòu)體），依據(jù)它們的結(jié)構(gòu)與激活機制分為三類：傳統(tǒng)型PKC（cPKC，包括α、βI、βII和γ），新型PKC（nPKC，包括δ、ε、π和θ），非典型PKC（aPKC，包括ζ、/λ）。在近幾年的研究中，發(fā)現(xiàn)PKC各亞型的過度激活參與了各種心臟疾病[20,31]。有研究表明，激活PKCδ會導(dǎo)致線粒體丙酮酸脫氫酶激酶激活,這抑制了丙酮酸脫氫酶和ATP再生并且還會觸發(fā)細胞壞死[12,13,10]；因此，我們假定，PKC過度激活可能是此類藥物產(chǎn)生心肌細胞毒性的重要途徑。為驗證我們的假設(shè)，本實驗利用離體培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞（NRVMs），研究PKC抑制劑或抑制肽（主要研究心肌中富含的cPKCs和nPKCs中的PKCδ、ε亞型）對TKIs藥物伊馬替尼（Imatinib，IM）和蘇尼替尼(Sunitinib,SU)導(dǎo)致的心肌細胞毒性作用的影響。研究對闡明TKIs類藥物心臟毒性機制、防治心臟毒性提供實驗依據(jù)。 目的： 研究cPKCs和PKCδ、ε亞型抑制劑或抑制肽對IM和SU導(dǎo)致的心肌細胞毒性作用的影響。 方法： 新生1-2天SD大鼠，分離心室肌細胞，用DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)三天，首先分別孵育不同濃度的IM（2、5、10M）和SU（1、5、10M），在48h用ATP檢測試劑盒和FLUOstarOmega全自動多功能酶標(biāo)儀檢測細胞內(nèi)ATP的含量，72h用LDH檢測試劑盒和FLUOstar Omega全自動多功能酶標(biāo)儀檢測細胞外LDH釋放量，線粒體膜電位檢測試劑盒和激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體膜電位（MMP）的改變。然后，觀察非選擇性、選擇性PKC抑制劑或抑制肽對IM和SU細胞毒性的影響。實驗數(shù)據(jù)均用OriginPro8.6進行數(shù)據(jù)分析，采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，n代表實驗重復(fù)次數(shù)。兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，P0.05時認為兩組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： (1) IM和SU對NRVMs的毒性作用 不同濃度IM（2、5、10M）和SU（1、5、10M）與NRVMs孵育48h細胞內(nèi)ATP含量呈濃度依賴性減少，72h檢測的LDH釋放量亦隨著濃度的增加而明顯增多。 分別孵育10M的IM和SU，于24、48及72h三個時間點檢測細胞內(nèi)ATP的含量，LDH釋放量以及MMP變化。結(jié)果顯示， IM和SU組的ATP含量于48h明顯降低，約為對照組含量的50%，72h含量繼續(xù)下降，只有對照組含量的20%；LDH的釋放量在48h IM和SU顯著升高，72h釋放量繼續(xù)升高，IM組是對照組的兩倍，SU組是對照組的三倍。MMP測量顯示，在24h，IM和SU組MMP均明顯降低，IM組降低到對照組的50%，SU組降低到對照組30%，48、72h MMP呈繼續(xù)降低趨勢。 上述結(jié)果表明，在離體培養(yǎng)NRVMs上，IM和SU能夠產(chǎn)生明顯心肌細胞毒性，并且毒性呈現(xiàn)濃度依賴性和時間依賴性，從檢測的指標(biāo)上看，線粒體膜電位的下降是最早出現(xiàn)的毒性表現(xiàn)。 (2)非選擇性PKC抑制劑Bis-1對IM和SU毒性的影響 在NRVMs中，Bis-1（100nM）分別與IM（2、5、10M）,和SU（1、5、10M）,孵育48h檢測ATP含量,孵育72h檢測LDH釋放量。單獨孵育Bis-1上述指標(biāo)與對照組無明顯差別，而加入Bis-1使三個濃度下IM和SU組的ATP含量和LDH釋放量均恢復(fù)到對照組水平；單獨孵育Bis-1對MMP無明顯影響，Bis-1與IM或SU共孵育可顯著逆轉(zhuǎn)所有濃度MMP值的下降。透射電鏡掃描結(jié)果顯示， IM和SU引發(fā)線粒體形態(tài)發(fā)生顯著變化，多數(shù)線粒體產(chǎn)生空泡、腫脹或髓樣化改變。而共同孵育Bis-1的IM和SU組細胞中線粒體恢復(fù)正常形態(tài)。上述實驗結(jié)果表明，非選擇PKC抑制劑Bis-1對IM、SU導(dǎo)致的心肌細胞毒性有拮抗作用。 (3)選擇性PKC抑制劑或抑制肽對IM和SU毒性的影響 G6976是cPKC抑制劑，G6976（100nM）與IM或SU共孵育并不影響MMP值、 ATP含量以及LDH的釋放。同樣，高選擇性PKC抑制肽（500nM）對IM和SU引發(fā)的上述指標(biāo)改變無明顯影響，表明傳統(tǒng)型PKC亞型抑制不能對抗IM和SU引起的心肌細胞毒性。Rotterlin是PKC選擇性抑制劑,單獨孵育Rotterlin（500nM）不影響MMP值、 ATP含量以及LDH的釋放，但Rotterlin可完全取消IM和SU引起的上述各項指標(biāo)的變化。選擇性PKC抑制肽（500nM）亦可顯著對抗IM和SU導(dǎo)致的各項指標(biāo)的變化，而其亂碼對照肽不能對抗IM或SU導(dǎo)致的各項指標(biāo)的變化，表明選擇性抑制新型PKC和PKC對IM和SU的心肌細胞毒性具有明顯預(yù)防作用。 為進一步確認Rotterlin和PKCε抑制肽預(yù)防心肌毒性的作用，我們利用透射電子顯微鏡檢測了細胞線粒體亞顯微結(jié)構(gòu)。與IM引發(fā)的線粒體改變明顯不同的是，Rotterlin與IM共孵育線粒體亞顯微結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯空泡、腫脹或髓樣化改變；PKCε抑制肽存在下，IM雖然引發(fā)部分線粒體空泡化，但未見髓樣化改變。Rotterlin和PKCε抑制肽對SU引發(fā)線粒體改變具有與IM相似的保護作用。 以上實驗結(jié)果表明，選擇性抑制PKC δ和ε亞型能夠一定程度上預(yù)防IM和SU的心肌細胞毒性，而傳統(tǒng)型PKC亞型抑制不能對抗IM和SU引起的心肌細胞毒性。 結(jié)論： (1) IM SU能夠?qū)е碌男募〖毎拘裕⑶叶拘猿尸F(xiàn)濃度依賴性和時間依賴性，線粒體膜電位的下降是最早出現(xiàn)的毒性表現(xiàn)。 (2) PKC非選擇性抑制劑Bis-1對IM、SU導(dǎo)致的心肌細胞毒性具有抑制作用。 (3)選擇性新型PKC（而不是傳統(tǒng)型）抑制可顯著對抗IM和SU所致的細胞毒性。結(jié)果提示TKIs的心臟毒性機制可能與其新型PKC亞型活性增高有關(guān)，抑制這些PKC亞型可望有效防治TKIs類藥物的心臟毒性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R96

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 蔡明清;心肌細胞再生和腔室重塑[J];中國分子心臟病學(xué)雜志;2002年01期

2 李娜;;心肌細胞可以再生[J];科技導(dǎo)報;2009年08期

3 薛惠文;章靜波;;人類心肌細胞的更新[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2009年07期

4 崔曉兵;;人類成年心肌細胞可以更新[J];生理科學(xué)進展;2010年06期

5 蘇倩文;;心肌細胞可以再生[J];心血管病防治知識(科普版);2013年05期

6 周亮 ,曾曉榮,楊艷,劉智飛,李妙齡,裴杰;豚鼠心肌細胞急性酶分離方法[J];四川生理科學(xué)雜志;2000年02期

7 萬朝敏,俞紅吉,吳泰相,高云欽,周密,鄧建軍,王正榮;免疫損傷對離體培養(yǎng)心肌細胞力學(xué)特性的影響[J];中國醫(yī)學(xué)物理學(xué)雜志;2000年02期

8 賈士東,修瑞娟;心肌細胞功能的研究[J];中國微循環(huán);2000年03期

9 何作云,劉健;心肌細胞核鈣信號的研究[J];重慶醫(yī)學(xué);2002年02期

10 張家平;絲裂素活化蛋白激酶與心肌細胞效應(yīng)[J];重慶醫(yī)學(xué);2002年11期

相關(guān)會議論文 前10條

1 張保國;趙萍;張文杰;;鉬對培養(yǎng)心肌細胞存活的影響[A];中國營養(yǎng)學(xué)會首屆微量元素專題討論會論文摘要匯編[C];1985年

2 房亞東;黃躍生;黨永明;張家平;張東霞;宋華培;張瓊;;上調(diào)微管相關(guān)蛋白4對缺氧早期心肌細胞活力影響的實驗研究[A];中華醫(yī)學(xué)會燒傷外科學(xué)分會2009年學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2009年

3 唐陶;王世騏;莊茁;;基底應(yīng)變對心肌細胞的影響[A];北京力學(xué)會第14屆學(xué)術(shù)年會論文集[C];2008年

4 何作云;劉健;王培勇;;心肌細胞核鈣信號的研究[A];21世紀醫(yī)學(xué)工程學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2001年

5 何作云;劉健;;心肌細胞核鈣信號的研究[A];第九次全國生物物理大會學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2002年

6 滕苗;黃躍生;黨永明;房亞東;張瓊;;微管干預(yù)劑對缺氧心肌細胞糖酵解途徑關(guān)鍵酶的影響[A];第六屆全國燒傷救治專題研討會論文匯編[C];2009年

7 宋新愛;林元喜;樊小力;;心肌細胞的純化[A];中國病理生理學(xué)會第九屆全國代表大會及學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2010年

8 劉興茂;陳昭烈;劉紅;熊福銀;;心肌細胞體外三維培養(yǎng)的初步研究[A];中國生物工程學(xué)會第三次全國會員代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];2001年

9 熊江輝;李瑩輝;聶捷琳;張曉鈾;丁柏;;槲皮素對回轉(zhuǎn)條件下心肌細胞—氧化氮合成的影響[A];中國宇航學(xué)會航天醫(yī)學(xué)工程專業(yè)委員會、中國空間科學(xué)學(xué)會空間生命專業(yè)委員會聯(lián)合學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2001年

10 陽冬梅;吳才宏;程和平;;鈣調(diào)蛋白對心肌細胞興奮—收縮耦聯(lián)的調(diào)節(jié)作用[A];第九次全國生物物理大會學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2002年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 劉黎;荷蘭培育心肌細胞取得進展[N];中國中醫(yī)藥報;2008年

2 編譯 曉魚;人類心肌細胞可再生[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2009年

3 孫國根;心肌細胞的形成和再生有望被誘導(dǎo)[N];中國醫(yī)藥報;2012年

4 吳偉農(nóng);心肌細胞能自我修復(fù)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2001年

5 陳丹;移植的人體細胞可與豚鼠受體心肌同步跳動[N];科技日報;2012年

6 記者胡德榮;心肌細胞能體外培養(yǎng)[N];健康報;2002年

7 楊洋;骨髓細胞生成心肌細胞[N];衛(wèi)生與生活報;2003年

8 吳理茂 李連達;中藥在心肌細胞移植中的作用[N];中國醫(yī)藥報;2003年

9 ;急性心梗治療獲重要突破 心肌細胞可以再生[N];中國保險報;2003年

10 記者 張曄;基因調(diào)控讓壞死的心肌細胞“復(fù)活”[N];科技日報;2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 吳東棟;硫化氫提高Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活性的作用及其機制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

2 徐磊;MMI-0100通過對心肌細胞及成纖維細胞中MK2的抑制作用降低心肌纖維化程度的研究[D];山東大學(xué);2015年

3 牟永潮;基于納米材料再造心肌組織生物學(xué)評價與心梗治療研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2015年

4 李娜;PDE5抑制劑Sildenafi1對心梗后心衰線粒體能量代謝保護及機制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

5 陳亮;miR-199a對大鼠心肌細胞自噬的調(diào)控研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

6 王曉麗;附子人參配伍對大鼠心肌細胞保護作用的研究[D];長春中醫(yī)藥大學(xué);2015年

7 肖劍鋒;碘化-N-正丁基氟哌啶醇對缺氧心肌細胞鈣穩(wěn)態(tài)的保護作用[D];汕頭大學(xué);2011年

8 張翠翠;MG53調(diào)節(jié)心臟輔助亞基KChIP2表達的分子機制及在心電穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中的作用[D];南方醫(yī)科大學(xué);2014年

9 張海彬;miR-711在心肌缺血再灌注損傷中的作用機制[D];吉林大學(xué);2016年

10 位庚;心肌微血管內(nèi)皮細胞損傷對心肌細胞的影響及通絡(luò)干預(yù)研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 付麗;硫化氫后處理對大鼠缺氧/復(fù)氧心肌細胞的保護作用及機制研究[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2015年

2 黃玉潔;miR-218調(diào)控小鼠胚胎干細胞體外定向分化心肌細胞研究[D];浙江大學(xué);2015年

3 李品雅;華蟾毒精對心肌細胞L型鈣電流，鈣瞬變和收縮力的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

4 劉洋;野薔薇苷對H_2O_2誘導(dǎo)心肌細胞氧化損傷的保護作用及其機制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

5 朱燕梅;銀杏葉提取物保護心肌細胞抗氧化損傷及其基于Keap1/Nrf2/ARE通路的作用機制[D];成都醫(yī)學(xué)院;2015年

6 劉莉;心肌細胞TLR4促進心梗后心臟炎癥反應(yīng)的研究[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2015年

7 盧杏;體外轉(zhuǎn)染CyclinA2基因?qū)υ笫笮募〖毎鲋车挠绊慬D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2015年

8 竇夢怡;缺氧時心肌細胞自噬的變化及其機理的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

9 蘭曉東;微管解聚對心肌細胞電生理特性的影響及微管定量分析方法研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

10 李熠;TGR5在高糖誘導(dǎo)小鼠心肌細胞凋亡中的作用及其機制[D];四川醫(yī)科大學(xué);2015年

本文編號：2323694