【摘要】：課題來源： 廣東省科技計劃項目《多西紫杉醇和卡鉑化療序貫Gefitinib一線治療晚期NSCLC的系列研究》(基金項目編號：20098030801035)。 目的： 通過系統(tǒng)的研究,建立Gefitinib微透析采樣方法,并采用內(nèi)標(biāo)微透析-血藥濃度聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行Gefitinib的藥動學(xué)研究,為抗腫瘤藥物的靶向性研究提供新的思路,亦為微透析技術(shù)應(yīng)用于油水難溶性及高蛋白結(jié)合型藥物的藥動學(xué)及藥效學(xué)研究提供新的途徑。 方法： 1建立Gefitinib HPLC分析方法 采用HPLC-UV,外標(biāo)法測定Gefitinib和Erlotinib生理鹽水(pH3.22)及甲醇溶液濃度,并考察色譜條件的專屬性、標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度、準(zhǔn)確度、定量限、檢測限、穩(wěn)定性等。 采用HPLC-UV,以Erlotinib為內(nèi)標(biāo)物,測定含藥血漿中Gefitinib濃度,考察色譜條件的專屬性、標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度、準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)、稀釋試驗、穩(wěn)定性以及血漿樣品處理回收率等。 2建立Gefitinib反向微透析采樣方法 采用濃差法(增量法、減量法)測定Gefitinib體外回收率(RR.g)及釋放率(RD.g),探討灌流液流速、灌流液pH、探針外液濃度、環(huán)境溫度對RR.g的影響及體內(nèi)外RR.g與RD.g的穩(wěn)定性,分析討論反向微透析技術(shù)應(yīng)用于Gefitinib藥動學(xué)采樣的可行性。 3采用反向微透析技術(shù)測定Gefitinib離體血漿蛋白結(jié)合率 將微透析探針置于梯度濃度含藥血漿中,以生理鹽水溶液(pH3.22,含5%二甲基亞砜)為灌流液進(jìn)行灌流,待探針透析及藥物與蛋白結(jié)合達(dá)到平衡狀態(tài)后,收集透析液測定濃度。同法,以空白血漿為探針外液,灌流含藥生理鹽水溶液(pH3.22,含5%二甲基亞砜),測定探針RD.g。以RD.g等價于RR.g推算Gefitinib在梯度濃度離體血漿中的蛋白結(jié)合率。 4建立Gefitinib內(nèi)標(biāo)微透析采樣方法 以Erlotinib為內(nèi)標(biāo)物,采用濃差法(增量法、減量法)測定Gefitinib與Erlotinib體外回收率(或釋放率)比值P,并探討灌流液流速、探針外液濃度、環(huán)境溫度對P值的影響及在體比值P'的穩(wěn)定性,分析討論內(nèi)標(biāo)微透析技術(shù)應(yīng)用于Gefitinib在體藥動學(xué)研究的可行性。 5傳統(tǒng)血藥濃度法測定大鼠灌胃或靜脈注射給予Gefitinib的藥動學(xué)參數(shù) 大鼠灌胃或尾靜脈注射給予Gefitinib藥液后,自眼球后靜脈叢采血,以Erlotinib為內(nèi)標(biāo)物,HPLC法測定血藥濃度。采用WinNonlin4.0.1軟件對大鼠兩種給藥方式Gefitinib的血藥濃度(C)與時間(t)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,推算主要藥動學(xué)參數(shù)。 6內(nèi)標(biāo)微透析-血藥濃度聯(lián)用技術(shù)采樣測定大鼠灌胃或靜脈注射給予Gefitinib的藥動學(xué)參數(shù) 以脂肪乳注射液(20%,含Erlotinib0.508μg·mL-1)為灌流液,采用內(nèi)標(biāo)微透析技術(shù)采集大鼠灌胃或尾靜脈注射給予Gefitinib后心臟,腦部紋狀體及皮下三個采樣位點(diǎn)的游離藥物,并通過HPLC測定透析液濃度。以Erlotinib釋放率(RD.e)實(shí)時校正Gefitinib的RR.g,聯(lián)合血藥濃度法測定值,二次校正體內(nèi)藥物濃度。采用WinNonlin4.0.1軟件對大鼠兩種給藥方式Gefitinib的血藥濃度(C)與時間(t)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。 7建立人肺腺癌細(xì)胞(A549)培養(yǎng)方法 以人肺腺癌細(xì)胞(A549)為培養(yǎng)對象,優(yōu)化確立細(xì)胞復(fù)蘇,傳代,凍存,移植方案,奠定局部腫瘤動物模型基礎(chǔ)。 結(jié)果： 1外標(biāo)法測定Gefitinib生理鹽水(pH3.22)及甲醇溶液濃度的色譜條件 色譜柱(DIKMA, Platisil ODS,5μm,150×4.6mm);保護(hù)柱(通用型Security GuardTM);流動相：甲醇-水[含三乙胺02.%](80：20)：流速：1.0mL·min-1;檢測波長：330nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL。 2外標(biāo)法測定Gefitinib、Erlotinib生理鹽水溶液(pH3.22)濃度及內(nèi)標(biāo)法測定Gefitinib含藥血漿濃度的色譜條件 色譜柱(DIKMA, Platisil ODS,5μm,150×4.6mm);保護(hù)柱(通用型Security GuardTM);流動相：甲醇-10mmol·L-1乙酸銨(70:30)；流速：1.0mL·min-1;檢測波長：330nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL。 3Gefitinib反向微透析采樣方法參數(shù) 灌流液(生理鹽水,pH3.22)流速：1.0μL·min-1;采樣間隔：15min,采樣量：15μL。反向微透析法測得Gefitinib的RR.g與RD.g對灌流液流速呈良好一致性。RR.g與灌流液pH呈反向相關(guān),而隨探針外液溫度升高而升高,對探針外液濃度變化保持恒定,且體內(nèi)外日內(nèi)RR.g與RD.g穩(wěn)定性良好。 4反向微透析技術(shù)測定Gefitinib離體血漿蛋白結(jié)合率結(jié)果 Gefitinib離體蛋白結(jié)合率為(89.45±1.03)%(RSD1.16%),不同濃度組血漿蛋白結(jié)合率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 5Gefitinib內(nèi)標(biāo)微透析采樣方法參數(shù) 灌流液(Erlotinib生理鹽水溶液,pH3.22)；流速：1.0μL·min-1;采樣間隔：15min;采樣量：15μL。Gefitinib與Erlotinib體外回收率(釋放率)比值P相對灌流液流速、探針外液濃度、環(huán)境溫度保持恒定。腦探針、血液探針、線性探針在體P值均能保持良好穩(wěn)定性。 6傳統(tǒng)血藥濃度法測定大鼠灌胃或靜脈注射給予Gefitinib后的藥動學(xué)參數(shù) Gefitinib灌胃或尾靜脈給藥后,藥動學(xué)過程符合二室模型,口服絕對生物利用度為59.81%。 7內(nèi)標(biāo)微透析-血藥濃度聯(lián)用技術(shù)采樣測定大鼠灌胃或靜脈注射給予Gefitinib后的藥動學(xué)參數(shù) 灌胃或尾靜脈給予Gefitinib后,藥動學(xué)過程符合二室模型,口服絕對生物利用度為63.07%,主要藥動學(xué)參數(shù)與傳統(tǒng)血藥濃度法測得結(jié)果一致性良好。 結(jié)論： 1在既定的色譜條件下,Gefitinib與Erlotinib濃度與對應(yīng)峰面積及二者峰面積比值線性關(guān)系良好,專屬性、日內(nèi)日間精密度、穩(wěn)定性、基質(zhì)效應(yīng)、稀釋試驗、血漿樣品處理回收率等考察指標(biāo)均能滿足生物樣品檢測要求,采用HPLC-VU法能準(zhǔn)確穩(wěn)定地對Gefitinib及Erlotinib進(jìn)行定量分析。 2反向微透析法在12h之內(nèi)對Gefitinib的體內(nèi)外釋放率(回收率)能保持相對穩(wěn)定,但整體呈下降趨勢。同時,二者差異較大。因此,反向微透析法體外采集測定Gefitinib樣品可行。而在體內(nèi)實(shí)驗中,以釋放率代替回收率存在一定的誤差,僅可實(shí)現(xiàn)對Gefitinib短期代謝情況的初步評價。 3Gefitinib呈現(xiàn)高血漿蛋白結(jié)合率,在臨床應(yīng)用時可能出現(xiàn)結(jié)合藥物重新分散,引起副作用或毒性。因此,應(yīng)選擇合適劑量,并注意監(jiān)測患者血藥濃度。另外,圍繞提高Gefitinib游離藥物濃度的新型制劑的研究具有重要意義。 4以Erlotinib為內(nèi)標(biāo)物,進(jìn)行Gefitinib回收率實(shí)時校正切實(shí)可行。但因Gefitinib油水難溶性及高蛋白結(jié)合率的特點(diǎn),常規(guī)灌流液無法實(shí)現(xiàn)Gefitinib在體采集。因此,需對灌流液進(jìn)行改性或?qū)ふ倚滦凸嗔饕?以提高在體回收率。同時,需對在體P'值進(jìn)一步校正。 5與正常生理狀態(tài)相比,受試大鼠對Gefitinib吸收清除緩慢。因此,臨床使用時應(yīng)考慮藥物蓄積等問題。圍繞提高Gefitinib生物利用度,降低毒副作用的環(huán)糊精包合物、環(huán)糊精包合物脂質(zhì)體及磁性脂質(zhì)體等新型靜脈靶向給藥系統(tǒng)的研究具有重要意義。 6將傳統(tǒng)血藥濃度法與內(nèi)標(biāo)微透析技術(shù)聯(lián)合,對Gefitinib回收率進(jìn)行兩次實(shí)時校正,進(jìn)一步提高了微透析技術(shù)應(yīng)用于藥物藥動學(xué)研究的精準(zhǔn)度。該聯(lián)合技術(shù)可解決準(zhǔn)確測定微透析探針在體回收率的難題,且結(jié)合藥物在體蛋白結(jié)合率,即可準(zhǔn)確推算出體內(nèi)游離藥物濃度。因此,可以推廣應(yīng)用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R969.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2299796