發(fā)布時(shí)間：2018-10-25 10:56

【摘要】：埃博拉病毒為絲狀病毒科單股負(fù)鏈RNA病毒,最初于蘇丹南部和剛果(金)的埃博拉河地區(qū)發(fā)現(xiàn),可通過(guò)與攜帶病毒的動(dòng)物或人接觸傳染,且一旦感染致死率極高,其生物安全等級(jí)為4級(jí),高于SARS病毒與HIV病毒,為對(duì)人類(lèi)危害最為嚴(yán)重的病毒之一�；诹柞０穯徇押塑�(Phosphorodiamidate Morpholino Oligonucleotides,PMOs)結(jié)構(gòu)的抗埃博拉病毒反義寡核苷酸AVI-7537為美國(guó)Sarepta Therapeutics公司(前AVI公司)研發(fā)的,由19個(gè)嗎啉代核苷以磷酰胺結(jié)構(gòu)連接而成的寡鏈,其可選擇性與埃博拉病毒核衣殼相關(guān)蛋白VP24的m RNA起始密碼子及下游結(jié)合,通過(guò)位阻作用使得對(duì)應(yīng)蛋白無(wú)法正確合成,最終抑制病毒感染進(jìn)程。已有研究表明該寡鏈可有效提升靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物感染埃博拉病毒后的存活率。PMOs結(jié)構(gòu)的類(lèi)模塊化結(jié)構(gòu)亦可通過(guò)改變組合方式實(shí)現(xiàn)寡鏈長(zhǎng)度與堿基序列排列的變化以結(jié)合不同的RNA序列,從而實(shí)現(xiàn)不同功能,尤其在抗病毒和治療遺傳病方面有著較為突出的優(yōu)勢(shì)。因此,對(duì)此結(jié)構(gòu)研究也是為建立基于PMOs結(jié)構(gòu)的反義寡核苷酸類(lèi)藥物平臺(tái)建立一定的理論和物料基礎(chǔ)。本研究主要基于現(xiàn)有文獻(xiàn)資料,對(duì)目標(biāo)反義寡核苷酸鏈合成中的所有中間產(chǎn)物進(jìn)行合成方法研究與合成工藝優(yōu)化,具體如下:研究目的:基于抗埃博拉反義寡核苷酸鏈AVI-7537,對(duì)所有PMOs成鏈前關(guān)鍵中間產(chǎn)物進(jìn)行合成研究,并進(jìn)行相關(guān)的結(jié)構(gòu)確證。對(duì)各關(guān)鍵中間產(chǎn)物合成方法進(jìn)行優(yōu)化研究,獲得一條高效、便捷、適合放大的合成路線。對(duì)PMOs結(jié)構(gòu)單元嗎啉代核苷單體進(jìn)行物料積累,建立嗎啉代核苷單體物質(zhì)庫(kù),為基于PMOs結(jié)構(gòu)的反義寡核苷酸藥物的進(jìn)一步研究建立一定理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。研究?jī)?nèi)容:(1)嗎啉代核苷單體合成研究:以堿基為腺嘌呤(A)、鳥(niǎo)嘌呤(G)、5-甲基尿嘧啶(T)、N4-苯甲酰胞嘧啶(C)的核苷為原料,對(duì)其結(jié)構(gòu)中的核糖部分進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,使其形成嗎啉核苷結(jié)構(gòu),并對(duì)相關(guān)基團(tuán)進(jìn)行保護(hù),使之成為嗎啉代核苷單體。(2)嗎啉代核苷單體合成工藝優(yōu)化研究:通過(guò)對(duì)不同方法的嘗試及改進(jìn),對(duì)嗎啉代核苷單體的合成方法進(jìn)行優(yōu)化,以得到操作便捷,收率較高,同時(shí)成本較為低廉的嗎啉代核苷單體合成工藝。(3)磷酰胺主干結(jié)構(gòu)的合成和工藝優(yōu)化研究:對(duì)AVI-7537中存在的二甲氨基磷酰二氯,以及N-(三氟乙�；哙夯�)-N-磷酰二氯2種主干連接體進(jìn)行合成研究,并對(duì)合成工藝進(jìn)行探索與優(yōu)化。(4)磷酰胺嗎啉代核苷的合成研究:以2種主干連接體與4種嗎啉核苷單體作為原料,進(jìn)行PMOs結(jié)構(gòu)成鏈單體磷酰胺嗎啉代核苷的合成研究,最終形成6種可直接合成AVI-7537及其他PMOs結(jié)構(gòu)所需成鏈前單體,包括4種磷酰二甲胺嗎啉代核苷單體以及2種磷酰哌嗪?jiǎn)徇塑諉误w。-(5)關(guān)鍵化合物的結(jié)構(gòu)分析研究以及嗎啉代核苷單體物質(zhì)庫(kù)的建立:對(duì)本研究中的關(guān)鍵化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析與確證,以確保所合成結(jié)構(gòu)的正確性,并對(duì)嗎啉代核苷單體進(jìn)行物料積累,建立嗎啉代核苷單體物質(zhì)庫(kù),為AVI-7537反義寡核苷酸鏈或其他基于PMOs結(jié)構(gòu)的反義寡核苷酸鏈研究打下一定的理論基礎(chǔ)和物質(zhì)基礎(chǔ)。研究結(jié)果:(1)嗎啉代核苷單體合成研究:分別以鳥(niǎo)苷、腺苷、N4-苯甲�；蘸�5-甲基尿苷作為原料,對(duì)N2-苯甲�；�-7?-羥基-N-三苯甲基嗎啉代鳥(niǎo)苷、N6-苯甲�；�-7?-羥基-N-三苯甲基嗎啉代腺苷、N4-苯甲�；�-7?-羥基-N-三苯甲基嗎啉代胞苷和7?-羥基-N-三苯甲基嗎啉代胸苷4種嗎啉代核苷單體進(jìn)行了合成。其中N2-苯甲�；�-7?-羥基-N-三苯甲基嗎啉代鳥(niǎo)苷、N4-苯甲�；�-7?-羥基-N-三苯甲基嗎啉代胞苷和7?-羥基-N-三苯甲基嗎啉代胸苷使用了“堿基伯氨保護(hù)(鳥(niǎo)苷)→嗎啉環(huán)合成→嗎啉環(huán)仲氨基三苯甲基保護(hù)”的路線1,N6-苯甲�；�-7?-羥基-N-三苯甲基嗎啉代腺苷則使用了“嗎啉環(huán)合成→嗎啉環(huán)仲氨基三苯甲基保護(hù)→堿基伯氨保護(hù)(腺苷)”的路線2。(2)嗎啉代核苷單體合成工藝優(yōu)化研究:分別對(duì)4種嗎啉代核苷單體的兩條合成路線進(jìn)行了優(yōu)化,與有完整詳細(xì)報(bào)道的文獻(xiàn)資料相比,采用優(yōu)化后工藝,以路線1合成的N4-苯甲�；�-7?-羥基-N-三苯甲基嗎啉代胞苷總收率達(dá)60.8%,比文獻(xiàn)報(bào)道收率高11.8%,7?-羥基-N-三苯甲基嗎啉代胸苷總收率為43.2%,與文獻(xiàn)報(bào)道基本持平,N2-苯甲酰基-7?-羥基-N-三苯甲基嗎啉代鳥(niǎo)苷收率26.9%,為未見(jiàn)報(bào)道的全新化合物,該工藝有操作方便、成本較低、收率可觀的優(yōu)點(diǎn),適合放大合成。采用優(yōu)化后工藝,以路線2合成的N6-苯甲�；�-7?-羥基-N-三苯甲基嗎啉代腺苷在反應(yīng)時(shí)間、產(chǎn)物純化便捷性上與原方法相比有較大優(yōu)勢(shì),適合放大合成,雖13.6%的收率低于文獻(xiàn)報(bào)道所述,但依舊遠(yuǎn)高于按文獻(xiàn)方法重復(fù)所得,產(chǎn)生該結(jié)果原因可能與所用試劑有關(guān)。(3)磷酰胺主干連接體結(jié)構(gòu)的合成和工藝優(yōu)化研究:對(duì)連接體結(jié)構(gòu)一,即N-(三氟乙�；哙夯�)-N-磷酰二氯的合成方法進(jìn)行了研究,對(duì)其合成步驟進(jìn)行了部分優(yōu)化,相比原工藝操作難度和部分物料使用量有所降低。對(duì)連接體二,即二甲氨基磷酰二氯的合成方法進(jìn)行了研究與篩選,確定了該物質(zhì)的最佳合成方法。N-(三氟乙�；哙夯�)-N-磷酰二氯與二甲氨基磷酰二氯的總收率分別為40.3%和75.4%。因連接體分子長(zhǎng)期保存易變質(zhì),故未對(duì)二者進(jìn)行大量物料積累。(4)磷酰胺嗎啉代核苷單體的合成研究:對(duì)AVI-7537中出現(xiàn)的直接參與成鏈的6種磷酰嗎啉代核苷單體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了合成研究,包括4種磷酰二甲氨基嗎啉代核苷單體和2種磷酰哌嗪基嗎啉代核苷單體。其中堿基為胸腺嘧啶的2種磷酰胺嗎啉代核苷單體收率相對(duì)較高,均超過(guò)40%,堿基為N2-苯甲�；B(niǎo)嘌呤的磷酰胺嗎啉代核苷單體收率較低,僅14.7%,其余3種磷酰胺嗎啉代核苷單體收率均約為30%。由于磷酰胺嗎啉代核苷并不穩(wěn)定,故未進(jìn)行物料積累。(5)關(guān)鍵化合物的結(jié)構(gòu)確證以及嗎啉代核苷單體物質(zhì)庫(kù)的建立:對(duì)4種嗎啉代核苷單體,2種磷酰胺連接體和6種磷酰胺嗎啉代核苷單體以及合成中關(guān)鍵步驟中間產(chǎn)物進(jìn)行了核磁或高分辨質(zhì)譜測(cè)定,保證了所合成物質(zhì)結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性。對(duì)PMOs合成中的最關(guān)鍵中間產(chǎn)物即4種嗎啉代核苷單體均進(jìn)行了各數(shù)十克的物料積累,充分滿足了后續(xù)AVI-7537寡鏈以及其他基于PMOs結(jié)構(gòu)反義寡核酸鏈的研究需求,為相關(guān)研究奠定了一定的物料基礎(chǔ)。目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)有PMOs合成相關(guān)研究。本研究無(wú)論是對(duì)國(guó)內(nèi)抗埃博拉病毒藥物研究方面,還是在其他基于PMOs結(jié)構(gòu)的反義藥物研發(fā)方面均可起到一定積極的促進(jìn)作用。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R914

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2293506