【摘要】：腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分,對(duì)腫瘤的生長,血管生成,免疫抑制,轉(zhuǎn)移和化學(xué)抗性等方面有著復(fù)雜和多樣作用。特別是經(jīng)極化后的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出了完全相反的免疫特性,顯著影響著癌癥治療的臨床效力。此外,伴隨著激酶抑制劑和細(xì)胞因子類藥物的快速發(fā)展,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞作為一種具有免疫治療潛力的潛在靶標(biāo)而受到了越來越廣泛的關(guān)注,靶向腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的相關(guān)研究亦在逐步深入。面對(duì)上述問題,本研究選擇理化性質(zhì)穩(wěn)定,制作方法簡易,形態(tài)可控性極高的無機(jī)納米粒子球型金納米粒作為考察對(duì)象,平行其他因素,深入探討金納米粒體內(nèi)和體外對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞定位和滲透能力的粒徑依賴性。以期為篩選合適粒徑的納米粒用以靶向腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞提供重要依據(jù)。聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)無毒、無刺激性,具有良好的水溶性同時(shí)兼具良好的生物相容性,且由于其抗蛋白吸附能力極強(qiáng),是被廣泛應(yīng)用的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)隱形材料。本課題將利用PEG的這些特性對(duì)金納米粒進(jìn)行聚乙二醇化修飾,進(jìn)而考察納米粒在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的粒徑依賴性定位和滲透。建立HS-PEG-FITC的熒光線性方程:Y=191.95X+10.319 R2=0.9998,線性范圍為:0.25~2.5μmol/L,用于調(diào)整對(duì)金納米粒進(jìn)行聚乙二醇化修飾時(shí),HS-PEG-NH2和HS-PEG-FITC的比例,使得異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)能夠定量的標(biāo)記不同粒徑的金納米粒,以滿足后期進(jìn)行流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和共聚焦觀察細(xì)胞內(nèi)定位的實(shí)驗(yàn)要求。選擇巨噬細(xì)胞細(xì)胞株RAW264.7、鼠源肝癌細(xì)胞Hepa1-6和人源乳腺癌細(xì)胞MCF-7三株細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。利用細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)建立腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)模型,對(duì)實(shí)體腫瘤微環(huán)境利用細(xì)胞系進(jìn)行體外模擬。并進(jìn)行體外細(xì)胞攝取和共培養(yǎng)條件下細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,5nm和20nm相比于粒徑較大的金納米粒細(xì)胞滲透的能力較強(qiáng),同時(shí)巨噬細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)化的程度要顯著高于腫瘤細(xì)胞;在共培養(yǎng)條件下,巨噬細(xì)胞的攝取情況基本無變化,而腫瘤細(xì)胞攝取的納米粒的量呈現(xiàn)略微下降的趨勢(shì)。在細(xì)胞共培養(yǎng)模型中進(jìn)行巨噬細(xì)胞的遷徙實(shí)驗(yàn)中,20nm的Au NPs表現(xiàn)出了較其他粒徑納米粒更強(qiáng)的誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞聚集的能力。選擇C57BL/6雄性小鼠和BALB/c雌性小鼠分別建立原位腫瘤模型,并結(jié)合梯度密度離心法和磁珠分選法對(duì)實(shí)體腫瘤組織中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞進(jìn)行提取和純化,同時(shí)從健康小鼠腹腔內(nèi)提取巨噬細(xì)胞作為對(duì)照,對(duì)TAMs進(jìn)行細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,20nm的Au NPs的在TAMs中的細(xì)胞內(nèi)化程度最高,用Au-PEG-FITC進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦觀察的結(jié)果也同樣證實(shí)了這一結(jié)果;與此同時(shí),激光共聚焦觀察結(jié)果顯示,5nm Au NPs相較其他粒徑較大的納米粒具有較為理想的細(xì)胞核內(nèi)定位效果。構(gòu)建小鼠乳腺癌模型并進(jìn)行體內(nèi)攝取實(shí)驗(yàn),選取先前實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為理想的5nm和20nm粒徑的Au NPs作為考察對(duì)象,通過體內(nèi)局部注射,體外流式檢測(cè)的方法對(duì)納米粒的滲透進(jìn)行考察。結(jié)果顯示,5 nm Au NPs滲透效果略好于20 nm,但并無顯著性差異;同時(shí),在體內(nèi)腫瘤微環(huán)境中,TAMs以不足10%的細(xì)胞比例攝取總量接近達(dá)到了腫瘤細(xì)胞的攝取總量的50%,可見較低粒徑的Au NPs對(duì)TAMs滲透效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于腫瘤細(xì)胞。本研究以納米金粒子作為工具和主要實(shí)驗(yàn)對(duì)象,并對(duì)其做功能化修飾,深入探討粒徑為5~100 nm的金納米粒對(duì)TAMs在體內(nèi)外滲透和定位的粒徑依賴性。結(jié)果顯示,低粒徑的納米粒在體內(nèi)外對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的滲透作用上體現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),其內(nèi)化程度也遠(yuǎn)高于腫瘤細(xì)胞;相較而言,5nm的Au NPs在細(xì)胞核內(nèi)定位效果良好,20nm的Au NPs對(duì)巨噬細(xì)胞的募集能力更強(qiáng)。本研究可以為靶向腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞納米載體設(shè)計(jì)和功能化選擇提供依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R943

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本文編號(hào)：2293438