發(fā)布時(shí)間：2018-10-10 06:41

【摘要】：近年來,由于抗生素的濫用導(dǎo)致了“超級(jí)細(xì)菌”(superbug)的出現(xiàn)和傳播。所謂“超級(jí)細(xì)菌”是指這些細(xì)菌對(duì)于目前的抗生素具有多重耐藥的特性,這對(duì)于臨床創(chuàng)傷感染的治療增添了很大的難度。且耐多重抗生素的超級(jí)細(xì)菌的爆發(fā)性流行盡管只是有潛在的可能,但其可怕之處卻引起了世界各國的恐慌。因此發(fā)展新的抗感染策略迫在眉睫。光動(dòng)力抗菌治療方法(photodynamic antimicrobial chemotherapy,PACT)就是其中最具前景的新療法之一,對(duì)于細(xì)菌、真菌和病毒引起的感染,特別是對(duì)于耐藥菌感染均顯示很好的療效。光動(dòng)力滅菌是基于光、光敏劑和氧三種因素協(xié)同作用的氧化損傷機(jī)制,不會(huì)因?yàn)閱我挥盟帯⒐饷魟┑臐舛�、曝光時(shí)間不足等因素產(chǎn)生耐藥問題。且超級(jí)細(xì)菌多發(fā)生在傷口、肺部以及血液和尿道中,除了血液感染外,其它部位采用PACT還是易于實(shí)現(xiàn)的,因而無論從耐藥性、殺菌性以及效果和方便考慮,PACT均有很大的優(yōu)勢。PACT的關(guān)鍵是光敏藥物。目前,國外利用不同光敏劑對(duì)不同細(xì)菌的光動(dòng)力滅活作用進(jìn)行了大量的探索,旨在發(fā)現(xiàn)理想的光敏藥物。理想的抗菌光敏劑,應(yīng)具有高效低毒和好的選擇性,對(duì)細(xì)胞壁的通透性強(qiáng),高效滅活微生物,而對(duì)于正常組織傷害較小。在國內(nèi)外以往的文獻(xiàn)報(bào)道中,作為抗菌的光敏藥物選擇性不夠突出,有些對(duì)于革蘭氏陽性菌有效,有些對(duì)革蘭氏陰性菌有效,對(duì)于上述兩類菌群均有效的高效光敏劑尚不多見,因而設(shè)計(jì)和發(fā)現(xiàn)可以有效治療上述兩類細(xì)菌的光敏藥物,將會(huì)大大拓展PACT的應(yīng)用。基于上述研究目標(biāo),我們開展了體內(nèi)體外光敏抗菌藥物的篩選,具體研究內(nèi)容涵蓋以下兩部分： 1.高效抗菌光敏劑的設(shè)計(jì)與篩選 1.1水溶性糖酞菁類光敏劑的光動(dòng)力抗菌作用研究 酞菁類光敏劑有其特有的優(yōu)勢,但是水溶性差、易聚集的缺點(diǎn)限制了酞菁的使用。考慮到細(xì)菌代謝和繁殖較快,我們利用半乳糖作為修飾基團(tuán),不僅可以改善酞菁的水溶性、生物相容性,而且可以提高細(xì)菌的選擇性攝取可使光敏藥物優(yōu)先聚集于細(xì)菌內(nèi)而非周圍組織或細(xì)胞中,從而實(shí)現(xiàn)選擇性滅菌。研究結(jié)果表明：細(xì)菌對(duì)四種酞菁類化合物(T1-T4)的吞噬量在30min時(shí)達(dá)到最大,隨著光照時(shí)間的延長,菌落數(shù)呈下降趨勢,在能量密度達(dá)到6J/cm2后,滅活率達(dá)到最大,且細(xì)菌的滅活率不再隨激光能量密度的增加而增加。在四種半乳糖取代的酞菁化合物(T1-T4)中,光照T1對(duì)革蘭氏陽性耐藥菌MRSA有很好的滅活作用且暗毒性較低,但對(duì)革蘭氏陰性菌(綠膿桿菌和大腸桿菌)的滅活效果卻很低。激光共聚焦顯微成像顯示MRSA對(duì)T1的吞噬量最多,T1的熒光最強(qiáng)。 1.2卟啉類光敏劑的光動(dòng)力抗菌作用研究 由于半乳糖酞菁類光敏劑對(duì)革蘭氏陽性菌有較好的殺菌效果,但對(duì)革蘭氏陰性菌殺菌效率很低,極大的限制了此類光敏劑的使用。卟啉類化合物是源于天然的另外一類光敏劑,但其母核的光敏效率與選擇性均不夠理想,考慮到細(xì)菌的增長分化需要大量的碳源和氮源。我們選擇雙乙二胺為對(duì)原卟啉化合物進(jìn)行修飾,得到一類新型的抗菌光敏劑。體外研究表明其對(duì)革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌在體外均有高效的抗菌滅活作用,以小鼠急性創(chuàng)傷感染為模型的在體實(shí)驗(yàn)表明,雙乙二胺的PACT作用可以明顯的殺死綠膿桿菌,促進(jìn)創(chuàng)傷面的愈合。 雙乙二胺光敏劑有其特有的抗菌優(yōu)勢,但是不穩(wěn)定,見光容易分解的缺點(diǎn)限制了其使用。為了進(jìn)一步研究氨基數(shù)目的取代關(guān)系對(duì)卟啉光敏劑的穩(wěn)定性、生物活性的影響,本實(shí)驗(yàn)室對(duì)雙乙二胺進(jìn)一步設(shè)計(jì),得到了五種氨基卟啉類化合物,體外實(shí)驗(yàn)表明：該五種卟啉類化合物PAl-PA5均具有較緩慢的光漂白率和較強(qiáng)的單線態(tài)氧產(chǎn)生能力,其中PA1的單線態(tài)氧產(chǎn)生率最高(0.69),高于四苯基卟啉(0.64),其余化合物PA1-PA4單線態(tài)氧產(chǎn)率在0.15-0.37之間。細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)表明MRSA,E.coli, P.aeruginosa在30min即對(duì)上述五種化合物的吞噬量達(dá)到最大。激光共聚焦顯微成像顯示上述三種菌株對(duì)五種化合物的吸收具有選擇性,對(duì)化合物PAl-PA2吞噬較強(qiáng),而對(duì)PA3-PA5吞噬卻較弱。光敏抗菌實(shí)驗(yàn)表明PA1產(chǎn)生的滅菌效果較其他四種化合物好,對(duì)三種菌的MIC均為16μM,對(duì)MRSaA,E.coli的MBC為31μM,對(duì)P.aeruginosa的MBC為62.5μM。PAl的暗毒性也低(MBC500μM)。利用菌落計(jì)數(shù)法檢測了PA1-PA5對(duì)三種細(xì)菌的光反應(yīng)、暗反應(yīng)濃度曲線。結(jié)果表明隨著濃度的增加,PA1表現(xiàn)出明顯的殺菌效果,對(duì)MRSA的殺菌效果最強(qiáng),當(dāng)濃度為15.6μM時(shí),全部殺死革蘭氏陽性菌MRSA.當(dāng)濃度上升為31.25μM時(shí),PA1幾乎能全部殺死E.coli,P.aeruginosa。但在此濃度范圍內(nèi)對(duì)3T3成纖維細(xì)胞的損傷卻很小。 以上結(jié)果表明PA1對(duì)革蘭氏陽性菌及陰性菌均有很好的抗菌性能,可作為一種新型廣譜的抗菌光敏劑使用,具有廣闊的前景。 2卟啉類抗菌光敏劑在皮膚感染類疾病中的光敏抗菌效果評(píng)價(jià) 2.1光敏抗菌對(duì)創(chuàng)傷感染的效果評(píng)價(jià) 皮膚破損性疾病是一種臨床常見病、多發(fā)病,由于多重耐藥細(xì)菌的出現(xiàn),臨床治療面臨很大的難度。以篩選出的苗頭化合物PA1為研究對(duì)象,重點(diǎn)探討PA1對(duì)由MRSA,E.coli,P.aeruginosa混合感染的大鼠創(chuàng)面模型的PACT作用,結(jié)果表明：PA1介導(dǎo)的PACT能促進(jìn)大面積創(chuàng)傷感染的大鼠皮膚愈合.其機(jī)制可能與誘導(dǎo)bFGF,TGF-β1的高表達(dá),促進(jìn)創(chuàng)面纖維合成和重新分布有關(guān)。造模后4,10及14天,高劑量PACT組的bFGF和TGF-β1的表達(dá)最高,模型對(duì)照組最低(P0.01).PACT能顯著改善創(chuàng)面感染組織炎癥狀況,降低組織中炎癥相關(guān)因子TNF-a和IL-6含量。減少創(chuàng)面組織中細(xì)菌的數(shù)量,加快創(chuàng)面愈合的速率。PACT的效果與PA1的濃度呈正相關(guān),表現(xiàn)出較好的劑量依賴關(guān)系。 大面積創(chuàng)傷發(fā)生時(shí),由于屏障系統(tǒng)被破壞,細(xì)菌很容易穿透屏障,造成敗血癥。盡管PACT可以外用,體內(nèi)卻只能靠自身免疫力清除細(xì)菌,如果感染程度超過自身免疫力則容易引起敗血癥。基于這種考慮將PACT和抗生素的優(yōu)勢結(jié)合起來,PACT可以清除外表細(xì)菌,而體內(nèi)細(xì)菌則由抗生素清除。基于大鼠創(chuàng)傷模型的實(shí)驗(yàn)表明：PACT聯(lián)合抗生素治療能顯著降低大鼠大面積重度感染組織的炎癥表達(dá)；減少創(chuàng)面組織中細(xì)菌數(shù)量,促進(jìn)創(chuàng)面愈合,結(jié)果優(yōu)于PACT治療組和抗生素治療組。PACT聯(lián)合抗生素治療大鼠大面積重度感染,死亡率為20%,而模型對(duì)照組的死亡率是60%,表明PACT聯(lián)合抗生素治療的有效性。免疫組化分析表明PACT聯(lián)合抗生素治療可顯著提高創(chuàng)面組織中bFGF(?)TGF-β1的含量表達(dá),促進(jìn)創(chuàng)面纖維合成和重新分布,加快創(chuàng)面愈合的速率,同時(shí)顯著降低創(chuàng)面組織中炎癥相關(guān)因子TNF-α和IL-6含量,減少創(chuàng)傷組織的炎癥反應(yīng),有助于創(chuàng)傷組織的修復(fù)。 2.2光敏抗菌作用在燒傷感染中的效果評(píng)價(jià) 燒燙傷(bums/scalds)是皮膚創(chuàng)傷的一種常見形式,為臨床常見病和多發(fā)病。細(xì)菌感染是燒傷患者的主要并發(fā)癥,發(fā)病率高,是造成病人死亡的主要因素,因此抗感染成為治療燒傷病人的重要環(huán)節(jié)。PACT聯(lián)合抗生素治療大鼠Ⅲ度燒傷感染結(jié)果表明,PACT聯(lián)合抗生素治療能顯著降低燒傷感染組織的炎癥表達(dá)；減少創(chuàng)面組織中細(xì)菌數(shù)量,促進(jìn)創(chuàng)面愈合,結(jié)果優(yōu)于PACT治療組和抗生素治療組。(?)PACT聯(lián)合抗生素治療大鼠Ⅲ度燒傷感染,死亡率為0%,而模型對(duì)照組的死亡率是50%。免疫組合分析表明PACT聯(lián)合抗生素治療可顯著提高創(chuàng)面組織中bFGF和新生血管數(shù)CD31的含量表達(dá),促進(jìn)血管新生和成纖維細(xì)胞的增殖,促進(jìn)了創(chuàng)面肉芽組織的生長,從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合,同時(shí)可以提高機(jī)體的自身免疫能力顯著降低燒傷創(chuàng)面組織中炎癥相關(guān)因子TNF-α和IL-6含量,減少創(chuàng)傷組織的炎癥反應(yīng),有助于創(chuàng)傷組織的修復(fù)。 綜上所述,PA1是一種具有良好抗菌效果的廣譜光敏劑,體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)表明,該光敏劑具有高效、低毒的性質(zhì),可作為一種新型廣譜的抗菌光敏劑使用,具有廣闊的前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R978

【參考文獻(xiàn)】

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1 趙京禹;付小兵;雷永紅;韓冰;孫同柱;;大鼠小面積全層皮膚缺損創(chuàng)面模型的制備[J];感染.炎癥.修復(fù);2008年01期

2 Smith DJ;Frame JD;Benhaim P;Phnlips LG;Zellweger G;葛繩德;;燒傷和創(chuàng)傷后革蘭陽性細(xì)菌感染[J];國外醫(yī)學(xué).創(chuàng)傷與外科基本問題分冊;1993年01期

3 譚黎明;唐小異;趙敏;譚鋼文;周源;;黃連、黃芩提取物對(duì)燙傷后感染銅綠假單胞菌的藥效初步觀察[J];湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年01期

4 朱立新,耿小平,范上達(dá);多種血管新生指標(biāo)在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及敏感性比較[J];消化外科;2003年03期

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