【摘要】：研究目的 基于定量蛋白質組學的研究方法，利用液相色譜-串聯(lián)質譜技術（LC-MS/MS），建立測定大鼠和人肝微粒體中藥物代謝酶亞型的分析方法，然后通過制備并測定大鼠和人的肝微粒體樣本，獲得肝微粒體中各藥物代謝酶亞型的表達水平數(shù)據(jù)，同時和傳統(tǒng)探針法進行對照，為藥物研發(fā)和臨床安全用藥過程中藥物代謝酶的研究提供新的途徑。 研究方案 通過對7種大鼠藥物代謝酶CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、UGT2B17、UGT2B2和UGT1A1理論胰蛋白酶水解肽段的氨基酸序列的分析，確定能代表各藥物代謝酶亞型的特征肽段，人工合成特征肽段標準品；利用液相色譜-串聯(lián)質譜技術（LC-MS/MS），通過優(yōu)化液相色譜流動相組成、洗脫梯度，離子源等相關質譜參數(shù)，采用多反應監(jiān)測模式，建立針對特征肽段的LC-MS/MS檢測方法；通過選擇合適的酶濃度和酶解時間并采用固相萃取過程確定肝微粒體樣品的制備方法；實驗中制備含有肝微粒體基質的溶液，并合成穩(wěn)定同位素標記的特征肽段，考察基質對建立特征肽段的標準工作曲線的影響；最后，通過測定大鼠肝微粒體樣本，得到藥物代謝酶表達水平數(shù)據(jù)。 通過對7種人的P450酶CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5、CYP2C9、CYP2C19和CYP2E1的理論胰蛋白酶水解肽段的氨基酸序列進行分析，確定能代表各P450酶亞型的特征肽段，人工合成具有相同序列的穩(wěn)定同位素標記的特征肽段標準品；利用液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用技術（LC-MS/MS），采用多反應監(jiān)測模式，建立針對特征肽段與其穩(wěn)定同位素標記肽段的LC-MS/MS定量方法；制備并測定12例人肝微粒體樣本，得到相關P450酶亞型含量的數(shù)據(jù)；分別以蟾蜍靈（Bufalin）和咪達唑侖（Midazolam）為探針底物，進行肝微粒體孵育，得到CYP3A酶活性數(shù)據(jù)，將CYP3A4和CYP3A5酶含量數(shù)據(jù)和酶活性數(shù)據(jù)進行相關性分析，考察新的探針底物蟾蜍靈的底物專一性以及所得P450酶含量數(shù)據(jù)的準確性。 設計一種帶有酶切位點的穩(wěn)定同位素標記肽段作為內(nèi)標。首先考察帶有酶切位點肽段的酶解過程。然后以鼠源肝微粒體中藥物代謝酶CYP2A1、CYP2D26和UGT1A1為研究對象，以三種不同的形式加入同位素標記內(nèi)標肽段。考察以三種形式加入內(nèi)標肽段對測定結果的影響，同時考察了酶解過程時間長短對測定結果的影響。 研究結果 本研究確定代表大鼠CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、UGT2B17、UGT2B2和UGT1A1酶的特征肽段序列依次為GNPESSFNDANLR、YIDFVPIPLPR、 VHEEIEQVIGR、 FADIVPTNIPHMTSR、 IILNELAQR、LLDVWTYELPR、SVFDQDPFLLR，用于多反應監(jiān)測定量的離子對依次為m/z711.1/625.5、665.6/692.4、437.0/345.2、567.2/577.4、535.5/843.5、702.7/964.5、669.1/645.1，用于定量的標準工作曲線依次為y=820x+1560（r=0.9982）、y=904x 733（r=0.9977）、y=1190x 7210（r=0.9985）、y=1170x 3330（r=0.9993）、y=509x 567（r=0.9996）、y=222x 720（r=0.9981）、y=835x 2420（r=0.9969），測得的酶含量依次為11.77、15.80、26.82、18.30、11.47、27.17和17.30pmol/mgprotein。以合成的穩(wěn)定同位素標記特征肽段作為內(nèi)標，對UGT1A1進行定量，結果顯示，特征肽段與其同位素標記肽段色譜行為與質譜響應一致，在基質溶液中同位素標記肽段線性關系良好，利用標準曲線法和穩(wěn)定同位素標記肽段作為內(nèi)標法測得UGT1A1含量分別為17.30pmol/mg protein和18.23pmol/mg protein，兩種方法所得結果基本一致，，但以穩(wěn)定同位素標記肽段作為內(nèi)標法操作簡便，更適用于復雜樣品的高通量測定。 本研究確定代表人CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5、CYP2C9、CYP2C19和CYP2E1酶的特征肽段序列依次為YLPNPALQ、FSVTTMR、EVTNFLR、 SLGPVGFMK、 SHMPYTDAVVHEVQR、 HFPLAER、GIIFNNGPTWK，測得酶的平均含量依次為39.3、4.3、54.0、4.6、10.3、3.0和9.3pmol/mg protein；不同P450亞型的表達水平差別較大，同一P450亞型存在明顯的個體差異；吸煙個體中CYP1A2的表達水平稍高，其他酶的表達水平稍低；相關性分析結果可知，以蟾蜍靈為底物測得的酶活性數(shù)據(jù)與CYP3A4含量數(shù)據(jù)相關性最好，作為CYP3A4底物，蟾蜍靈的專一性比咪達唑侖更強。同時說明，本實驗建立的人P450亞型絕對定量方法準確可靠。 實驗結果表明，當肽段的酶切位點兩端分別增加3個氨基酸時，該帶有酶切位點的肽段就能夠被胰蛋白酶水解。選用帶有酶切位點的穩(wěn)定同位素標記肽段作為內(nèi)標時，可以提高測定結果的準確度和精密度。適當延長酶解過程的時間，有利于提高測定結果的準確度。 通過以上三部分實驗，建立了針對藥物代謝酶的定量分析方法，為藥物相關領域中藥物代謝酶的研究提供了新的途徑。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R969.1;O657.63

【參考文獻】

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1 鐘大放;以加權最小二乘法建立生物分析標準曲線的若干問題[J];藥物分析雜志;1996年05期

本文編號：2258207