【摘要】：研究目的 基于定量蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（LC-MS/MS），建立測(cè)定大鼠和人肝微粒體中藥物代謝酶亞型的分析方法，然后通過制備并測(cè)定大鼠和人的肝微粒體樣本，獲得肝微粒體中各藥物代謝酶亞型的表達(dá)水平數(shù)據(jù)，同時(shí)和傳統(tǒng)探針法進(jìn)行對(duì)照，為藥物研發(fā)和臨床安全用藥過程中藥物代謝酶的研究提供新的途徑。 研究方案 通過對(duì)7種大鼠藥物代謝酶CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、UGT2B17、UGT2B2和UGT1A1理論胰蛋白酶水解肽段的氨基酸序列的分析，，確定能代表各藥物代謝酶亞型的特征肽段，人工合成特征肽段標(biāo)準(zhǔn)品；利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（LC-MS/MS），通過優(yōu)化液相色譜流動(dòng)相組成、洗脫梯度，離子源等相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，建立針對(duì)特征肽段的LC-MS/MS檢測(cè)方法；通過選擇合適的酶濃度和酶解時(shí)間并采用固相萃取過程確定肝微粒體樣品的制備方法；實(shí)驗(yàn)中制備含有肝微粒體基質(zhì)的溶液，并合成穩(wěn)定同位素標(biāo)記的特征肽段，考察基質(zhì)對(duì)建立特征肽段的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的影響；最后，通過測(cè)定大鼠肝微粒體樣本，得到藥物代謝酶表達(dá)水平數(shù)據(jù)。 通過對(duì)7種人的P450酶CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5、CYP2C9、CYP2C19和CYP2E1的理論胰蛋白酶水解肽段的氨基酸序列進(jìn)行分析，確定能代表各P450酶亞型的特征肽段，人工合成具有相同序列的穩(wěn)定同位素標(biāo)記的特征肽段標(biāo)準(zhǔn)品；利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS），采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，建立針對(duì)特征肽段與其穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段的LC-MS/MS定量方法；制備并測(cè)定12例人肝微粒體樣本，得到相關(guān)P450酶亞型含量的數(shù)據(jù)；分別以蟾蜍靈（Bufalin）和咪達(dá)唑侖（Midazolam）為探針底物，進(jìn)行肝微粒體孵育，得到CYP3A酶活性數(shù)據(jù)，將CYP3A4和CYP3A5酶含量數(shù)據(jù)和酶活性數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，考察新的探針底物蟾蜍靈的底物專一性以及所得P450酶含量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。 設(shè)計(jì)一種帶有酶切位點(diǎn)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段作為內(nèi)標(biāo)。首先考察帶有酶切位點(diǎn)肽段的酶解過程。然后以鼠源肝微粒體中藥物代謝酶CYP2A1、CYP2D26和UGT1A1為研究對(duì)象，以三種不同的形式加入同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)肽段。考察以三種形式加入內(nèi)標(biāo)肽段對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，同時(shí)考察了酶解過程時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。 研究結(jié)果 本研究確定代表大鼠CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、UGT2B17、UGT2B2和UGT1A1酶的特征肽段序列依次為GNPESSFNDANLR、YIDFVPIPLPR、 VHEEIEQVIGR、 FADIVPTNIPHMTSR、 IILNELAQR、LLDVWTYELPR、SVFDQDPFLLR，用于多反應(yīng)監(jiān)測(cè)定量的離子對(duì)依次為m/z711.1/625.5、665.6/692.4、437.0/345.2、567.2/577.4、535.5/843.5、702.7/964.5、669.1/645.1，用于定量的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線依次為y=820x+1560（r=0.9982）、y=904x 733（r=0.9977）、y=1190x 7210（r=0.9985）、y=1170x 3330（r=0.9993）、y=509x 567（r=0.9996）、y=222x 720（r=0.9981）、y=835x 2420（r=0.9969），測(cè)得的酶含量依次為11.77、15.80、26.82、18.30、11.47、27.17和17.30pmol/mgprotein。以合成的穩(wěn)定同位素標(biāo)記特征肽段作為內(nèi)標(biāo)，對(duì)UGT1A1進(jìn)行定量，結(jié)果顯示，特征肽段與其同位素標(biāo)記肽段色譜行為與質(zhì)譜響應(yīng)一致，在基質(zhì)溶液中同位素標(biāo)記肽段線性關(guān)系良好，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段作為內(nèi)標(biāo)法測(cè)得UGT1A1含量分別為17.30pmol/mg protein和18.23pmol/mg protein，兩種方法所得結(jié)果基本一致，但以穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段作為內(nèi)標(biāo)法操作簡(jiǎn)便，更適用于復(fù)雜樣品的高通量測(cè)定。 本研究確定代表人CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5、CYP2C9、CYP2C19和CYP2E1酶的特征肽段序列依次為YLPNPALQ、FSVTTMR、EVTNFLR、 SLGPVGFMK、 SHMPYTDAVVHEVQR、 HFPLAER、GIIFNNGPTWK，測(cè)得酶的平均含量依次為39.3、4.3、54.0、4.6、10.3、3.0和9.3pmol/mg protein；不同P450亞型的表達(dá)水平差別較大，同一P450亞型存在明顯的個(gè)體差異；吸煙個(gè)體中CYP1A2的表達(dá)水平稍高，其他酶的表達(dá)水平稍低；相關(guān)性分析結(jié)果可知，以蟾蜍靈為底物測(cè)得的酶活性數(shù)據(jù)與CYP3A4含量數(shù)據(jù)相關(guān)性最好，作為CYP3A4底物，蟾蜍靈的專一性比咪達(dá)唑侖更強(qiáng)。同時(shí)說明，本實(shí)驗(yàn)建立的人P450亞型絕對(duì)定量方法準(zhǔn)確可靠。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)肽段的酶切位點(diǎn)兩端分別增加3個(gè)氨基酸時(shí)，該帶有酶切位點(diǎn)的肽段就能夠被胰蛋白酶水解。選用帶有酶切位點(diǎn)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段作為內(nèi)標(biāo)時(shí)，可以提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度。適當(dāng)延長(zhǎng)酶解過程的時(shí)間，有利于提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度。 通過以上三部分實(shí)驗(yàn)，建立了針對(duì)藥物代謝酶的定量分析方法，為藥物相關(guān)領(lǐng)域中藥物代謝酶的研究提供了新的途徑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R969.1;O657.63

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 鐘大放;以加權(quán)最小二乘法建立生物分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的若干問題[J];藥物分析雜志;1996年05期

本文編號(hào)：2258206