【摘要】：Ⅲ型干擾素是近年來發(fā)現(xiàn)的由被感染的細(xì)胞和某些免疫細(xì)胞如漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞(p DCs)產(chǎn)生的具有與Ⅰ型干擾素相似功能的細(xì)胞因子。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)四個成員,分別命名為IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28A)、IFN-λ3(IL-28B)和IFN-λ4。它們與由IL-28R1和IL-10R2亞基組成的受體復(fù)合物結(jié)合,通過JAK-STAT信號通路發(fā)揮抗病毒等生物學(xué)作用。人Ⅲ型干擾素基因位于19號染色體長臂上,即19q13.13。IFN-λ1和IFN-λ2基因位于正鏈,IFN-λ3和IFN-λ4基因位于負(fù)鏈。IFN-λ1由5個外顯子組成,IFN-λ2和IFN-λ3由6個外顯子組成。IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3的啟動子區(qū)域包含干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)和IRF7的結(jié)合位點(diǎn)和至少一個有功能的NFκB結(jié)合位點(diǎn)。IFN-λ1的N端為19個氨基酸的信號肽,IFN-λ2和IFN-λ3的N端為25個氨基酸的信號肽。當(dāng)信號肽被切下后形成成熟的181個氨基酸的IFN-λ1或者175個氨基酸的IFN-λ2和IFN-λ3。IFN-λ4由IFNL4-delta G等位基因表達(dá)而來。其等位基因IFNL4-TT編碼IFN-λ4假基因,不表達(dá)有功能的蛋白質(zhì)。盡管IFN-λ4與其它3個Ⅲ型干擾素家族成員的同源性很低,但其結(jié)構(gòu)與其它3個成員相似,并且同樣與IL-28R1/IL-10R2受體結(jié)合,通過JAK-STAT信號通路,發(fā)揮功能。最近的研究發(fā)現(xiàn)IFN-λ3基因上游的單核苷酸多態(tài)性(SNP)與PEG-IFN-α聯(lián)合利巴韋林治療丙型肝炎的應(yīng)答相關(guān)。該SNP也與機(jī)體自發(fā)清除丙型肝炎病毒的能力相關(guān)。此外,IFN-λ4基因的單核苷酸多態(tài)性也與PEG-IFN-α聯(lián)合利巴韋林治療丙型肝炎的應(yīng)答及機(jī)體自發(fā)清除丙型肝炎病毒相關(guān)。人Ⅲ型干擾素受體的IL-28R1亞基的基因il28ra位于1號染色體1p36.11處,包含7個外顯子,所轉(zhuǎn)錄的m RNA存在3種剪接方式,可以產(chǎn)生3種不同的m RNA。IL-28R1全長520個氨基酸,其N端為20個氨基酸的信號肽。IL-28R1亞基由208個氨基酸的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、23個氨基酸的跨膜區(qū)及271個氨基酸的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。IL-28R1細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域有4個N-糖基化位點(diǎn)和1個O-糖基化位點(diǎn),細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域有3個酪氨酸殘基位點(diǎn)。其中Tyr343和Tyr517為STAT2和STAT5激活所必須。人Ⅲ型干擾素受體的IL-10R2亞基的基因il10r2位于21q22.11處,包含7個外顯子,編碼一條325個氨基酸的多肽,該多肽N端為19個氨基酸的信號肽。IL-10R2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域有4個N-糖基化位點(diǎn)和4個O-糖基化位點(diǎn)。IL-10R2細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域由79個氨基酸組成。IL-28R1是Ⅲ型干擾素專有的受體亞基,主要在粘膜上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞中表達(dá)。IL-28R1表達(dá)的細(xì)胞特異性決定了Ⅲ型干擾素的靶細(xì)胞特異性。而IL-10R2則是IL-10、IL-22、IL-26和Ⅲ型干擾素的共用受體亞基,其表達(dá)不具有細(xì)胞特異性。Ⅲ型干擾素與IL-28R1亞基結(jié)合,使之IL-10R2亞基結(jié)合形成受體復(fù)合物,進(jìn)而啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Ⅲ型干擾素除了具有直接抗病毒的活性以外,還可以通過上調(diào)MHCⅠ分子調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答,發(fā)揮抗病毒作用。大量研究表明,Ⅲ型干擾素是抵抗病毒感染粘膜上皮細(xì)胞的最重要免疫因子。但不同于Ⅰ型干擾素的嚴(yán)重而廣泛的副作用,Ⅲ型干擾素因其受體表達(dá)的特異性而限制了其作用的靶細(xì)胞范圍,降低了其副作用。因此,Ⅲ型干擾素在防治呼吸道和胃腸道病毒感染中極具應(yīng)用前景。Ⅲ型干擾素可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖。Ⅲ型干擾素通過上調(diào)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子p21的表達(dá)和促進(jìn)Rb的去磷酸化,誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯,抑制細(xì)胞增殖;同時,通過誘導(dǎo)凋亡蛋白TRAIL等的表達(dá),誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。Ⅲ型干擾素通過特定的靶細(xì)胞在抗病毒感染、腫瘤固有免疫防御方面發(fā)揮重要作用。但是,盡管Ⅲ型干擾素在預(yù)防和腫瘤發(fā)生、病毒感染和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用,目前只有PEG-IFN-λ1治療丙型肝炎病毒感染的方案進(jìn)行了臨床試驗(yàn)。PEG-IFN-λ1治療丙型肝炎的Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示PEG-IFN-λ1與PEG-IFN-α療效相似。與PEG-IFN-α相比,在12周前PEG-IFN-λ1可以更快的抑制病毒復(fù)制。在第24周時,PEG-IFN-λ1的病毒抑制率則與PEG-IFN-α基本相同。但是PEG-IFN-λ1治療的副作用很小。在接受PEG-IFN-λ1治療的患者中,很少發(fā)生嗜中性白細(xì)胞減少癥和血小板減少癥。盡管Ⅲ型干擾素具特異的抗病毒活性,且副作用很小,但是與Ⅰ型干擾素相比,其抗病毒活性要低很多。因此提高Ⅲ型干擾素的抗病毒生物活性具有重要意義。此外,在III型干擾素所有成員中,IFN-λ3的抗病毒活性最高,但只有IFN-λ1可以在原核表達(dá)系統(tǒng)里高效表達(dá),導(dǎo)致目前在臨床開發(fā)中的III型干擾素是IFN-λ1,而不是活性最高的IFN-λ3。近數(shù)十年對?干擾素的研究表明,將干擾素蛋白分子的序列稍做改變,有時可以使其在某一方面的活性(抗病毒或抑制細(xì)胞增殖)大大提高,如IFN-con和經(jīng)DNA shuffling產(chǎn)生的超級干擾素等。因此,結(jié)合IFN-λ1易于在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)和IFN-λ3高抗病毒活性的特點(diǎn),本文通過用IFN-λ1的序列置換IFN-λ3相對應(yīng)序列的方法設(shè)計(jì)了9個Ⅲ型干擾素嵌合體。為了避免產(chǎn)生免疫原性,我們選擇在IFN-λ1和IFN-λ3的序列完全相同的區(qū)域進(jìn)行置換,因此所設(shè)計(jì)的Ⅲ型干擾素嵌合體分子全都不帶任何非天然氨基酸序列。本文第一次系統(tǒng)地研究了IFN-λ1/3嵌合體的表達(dá)和純化,并且進(jìn)行了PEG修飾。隨后我們細(xì)致地研究了IFN-λ1/3嵌合體的活性和穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)PEG-analog-6誘導(dǎo)ISRE-luciferase報告基因表達(dá)的效率高于Ⅰ型干擾素PEG-IFN-α2a。PEG-analog-6和PEG-analog-7可以有效抑制丙型肝炎病毒和A型流感病毒的復(fù)制。并且PEG-analog-6和PEG-analog-7抑制流感病毒H3N2的效率高于Ⅰ型干擾素PEG-IFN-α2a。PEG-analog-6還可以抑制肺癌細(xì)胞株HCC827的增殖,誘導(dǎo)HCC827細(xì)胞STAT1磷酸化。此外還發(fā)現(xiàn)PEG-analog-6可以誘導(dǎo)HCC827細(xì)胞表達(dá)APOBEC3G。本文采用同家族基因序列置換的方法設(shè)計(jì)嵌合體蛋白質(zhì),并且證明了所設(shè)計(jì)的嵌合體蛋白質(zhì)生物活性獲得顯著提高。此蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)方法避免了引入非天然蛋白質(zhì)序列所引起的免疫源性問題,可用于設(shè)計(jì)和篩選安全有效的蛋白質(zhì)工程藥物。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.通過將Ⅲ型干擾素不同亞型之間的序列進(jìn)行置換的方法設(shè)計(jì)干擾素嵌合體,并進(jìn)行表達(dá)純化。發(fā)現(xiàn)以IFN-λ1序列為N端的嵌合體可以在大腸桿菌里高效表達(dá)和純化,而以IFN-λ3序列為N端的嵌合體則不能在大腸桿菌里表達(dá)。開發(fā)了一整套嵌合體干擾素的表達(dá)純化和修飾的工藝。2.通過檢測經(jīng)嵌合體干擾素處理的Hep G2細(xì)胞Mx A和OAS的表達(dá),證實(shí)4種嵌合體干擾素具有誘導(dǎo)干擾素應(yīng)答基因表達(dá)的活性。其活性與濃度呈正相關(guān),并且具有時間效應(yīng)。3.通過檢測干擾素信號通路關(guān)鍵蛋白STAT1的磷酸化與否,證實(shí)嵌合體干擾素可以誘導(dǎo)STAT1發(fā)生磷酸化,從而誘導(dǎo)干擾素應(yīng)答基因的表達(dá)。4.通過ISRE-luciferase報告基因細(xì)胞系定量研究嵌合體干擾素的活性,證實(shí)analog-6和analog-7的活性高于IFN-λ1,PEG-analog-6的活性比PEG-IFN-α2a高5倍,PEG-analog-7的活性與PEG-IFN-α2a接近。5.通過免疫熒光染色和實(shí)時定量PCR的方法證明了PEG-analog-6和PEG-analog-7嵌合體干擾素能夠抑制丙型肝炎病毒復(fù)制,其活性與PEG-IFN-α2a接近。6.通過ELISA的方法證實(shí)PEG-analog-6和PEG-analog-7嵌合體干擾素能夠抑制流感病毒的復(fù)制,并且PEG-analog-6的活性高于PEG-IFN-α2a。7.通過檢測放置于40℃的不同批次的嵌合體干擾素PEG-analog-6的濃度和純度變化的方法,證明PEG-analog-6蛋白具有高度的穩(wěn)定性。8.通過測定嵌合體干擾素對不同腫瘤細(xì)胞增殖的作用,發(fā)現(xiàn)嵌合體干擾素PEG-analog-6可以抑制肺癌細(xì)胞HCC827的增殖,誘導(dǎo)HCC827細(xì)胞凋亡,表達(dá)APBOEC3G。因此證實(shí)了嵌合體干擾素PEG-analog-6具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性,其活性高于PEG-IFN-λ1。本文研究結(jié)果表明嵌合體干擾素PEG-analog-6具有易于在大腸桿菌中表達(dá)和純化,穩(wěn)定性好,能夠誘導(dǎo)干擾素應(yīng)答基因的表達(dá),具有很高的抗病毒和抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性,為將其開發(fā)成蛋白質(zhì)藥物奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R91

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本文編號：2251942