【摘要】：Ⅲ型干擾素是近年來發(fā)現(xiàn)的由被感染的細胞和某些免疫細胞如漿細胞樣樹突細胞(p DCs)產生的具有與Ⅰ型干擾素相似功能的細胞因子。目前已經發(fā)現(xiàn)四個成員,分別命名為IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28A)、IFN-λ3(IL-28B)和IFN-λ4。它們與由IL-28R1和IL-10R2亞基組成的受體復合物結合,通過JAK-STAT信號通路發(fā)揮抗病毒等生物學作用。人Ⅲ型干擾素基因位于19號染色體長臂上,即19q13.13。IFN-λ1和IFN-λ2基因位于正鏈,IFN-λ3和IFN-λ4基因位于負鏈。IFN-λ1由5個外顯子組成,IFN-λ2和IFN-λ3由6個外顯子組成。IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3的啟動子區(qū)域包含干擾素調節(jié)因子3(IRF3)和IRF7的結合位點和至少一個有功能的NFκB結合位點。IFN-λ1的N端為19個氨基酸的信號肽,IFN-λ2和IFN-λ3的N端為25個氨基酸的信號肽。當信號肽被切下后形成成熟的181個氨基酸的IFN-λ1或者175個氨基酸的IFN-λ2和IFN-λ3。IFN-λ4由IFNL4-delta G等位基因表達而來。其等位基因IFNL4-TT編碼IFN-λ4假基因,不表達有功能的蛋白質。盡管IFN-λ4與其它3個Ⅲ型干擾素家族成員的同源性很低,但其結構與其它3個成員相似,并且同樣與IL-28R1/IL-10R2受體結合,通過JAK-STAT信號通路,發(fā)揮功能。最近的研究發(fā)現(xiàn)IFN-λ3基因上游的單核苷酸多態(tài)性(SNP)與PEG-IFN-α聯(lián)合利巴韋林治療丙型肝炎的應答相關。該SNP也與機體自發(fā)清除丙型肝炎病毒的能力相關。此外,IFN-λ4基因的單核苷酸多態(tài)性也與PEG-IFN-α聯(lián)合利巴韋林治療丙型肝炎的應答及機體自發(fā)清除丙型肝炎病毒相關。人Ⅲ型干擾素受體的IL-28R1亞基的基因il28ra位于1號染色體1p36.11處,包含7個外顯子,所轉錄的m RNA存在3種剪接方式,可以產生3種不同的m RNA。IL-28R1全長520個氨基酸,其N端為20個氨基酸的信號肽。IL-28R1亞基由208個氨基酸的細胞外結構域、23個氨基酸的跨膜區(qū)及271個氨基酸的細胞內結構域組成。IL-28R1細胞外結構域有4個N-糖基化位點和1個O-糖基化位點,細胞內結構域有3個酪氨酸殘基位點。其中Tyr343和Tyr517為STAT2和STAT5激活所必須。人Ⅲ型干擾素受體的IL-10R2亞基的基因il10r2位于21q22.11處,包含7個外顯子,編碼一條325個氨基酸的多肽,該多肽N端為19個氨基酸的信號肽。IL-10R2的細胞外結構域有4個N-糖基化位點和4個O-糖基化位點。IL-10R2細胞內結構域由79個氨基酸組成。IL-28R1是Ⅲ型干擾素專有的受體亞基,主要在粘膜上皮細胞和肝細胞中表達。IL-28R1表達的細胞特異性決定了Ⅲ型干擾素的靶細胞特異性。而IL-10R2則是IL-10、IL-22、IL-26和Ⅲ型干擾素的共用受體亞基,其表達不具有細胞特異性。Ⅲ型干擾素與IL-28R1亞基結合,使之IL-10R2亞基結合形成受體復合物,進而啟動信號轉導。Ⅲ型干擾素除了具有直接抗病毒的活性以外,還可以通過上調MHCⅠ分子調節(jié)免疫應答,發(fā)揮抗病毒作用。大量研究表明,Ⅲ型干擾素是抵抗病毒感染粘膜上皮細胞的最重要免疫因子。但不同于Ⅰ型干擾素的嚴重而廣泛的副作用,Ⅲ型干擾素因其受體表達的特異性而限制了其作用的靶細胞范圍,降低了其副作用。因此,Ⅲ型干擾素在防治呼吸道和胃腸道病毒感染中極具應用前景。Ⅲ型干擾素可以抑制多種腫瘤細胞的增殖。Ⅲ型干擾素通過上調細胞周期調節(jié)因子p21的表達和促進Rb的去磷酸化,誘導細胞周期阻滯,抑制細胞增殖;同時,通過誘導凋亡蛋白TRAIL等的表達,誘導癌細胞凋亡。Ⅲ型干擾素通過特定的靶細胞在抗病毒感染、腫瘤固有免疫防御方面發(fā)揮重要作用。但是,盡管Ⅲ型干擾素在預防和腫瘤發(fā)生、病毒感染和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用,目前只有PEG-IFN-λ1治療丙型肝炎病毒感染的方案進行了臨床試驗。PEG-IFN-λ1治療丙型肝炎的Ⅱ期臨床試驗結果顯示PEG-IFN-λ1與PEG-IFN-α療效相似。與PEG-IFN-α相比,在12周前PEG-IFN-λ1可以更快的抑制病毒復制。在第24周時,PEG-IFN-λ1的病毒抑制率則與PEG-IFN-α基本相同。但是PEG-IFN-λ1治療的副作用很小。在接受PEG-IFN-λ1治療的患者中,很少發(fā)生嗜中性白細胞減少癥和血小板減少癥。盡管Ⅲ型干擾素具特異的抗病毒活性,且副作用很小,但是與Ⅰ型干擾素相比,其抗病毒活性要低很多。因此提高Ⅲ型干擾素的抗病毒生物活性具有重要意義。此外,在III型干擾素所有成員中,IFN-λ3的抗病毒活性最高,但只有IFN-λ1可以在原核表達系統(tǒng)里高效表達,導致目前在臨床開發(fā)中的III型干擾素是IFN-λ1,而不是活性最高的IFN-λ3。近數(shù)十年對?干擾素的研究表明,將干擾素蛋白分子的序列稍做改變,有時可以使其在某一方面的活性(抗病毒或抑制細胞增殖)大大提高,如IFN-con和經DNA shuffling產生的超級干擾素等。因此,結合IFN-λ1易于在原核表達系統(tǒng)中表達和IFN-λ3高抗病毒活性的特點,本文通過用IFN-λ1的序列置換IFN-λ3相對應序列的方法設計了9個Ⅲ型干擾素嵌合體。為了避免產生免疫原性,我們選擇在IFN-λ1和IFN-λ3的序列完全相同的區(qū)域進行置換,因此所設計的Ⅲ型干擾素嵌合體分子全都不帶任何非天然氨基酸序列。本文第一次系統(tǒng)地研究了IFN-λ1/3嵌合體的表達和純化,并且進行了PEG修飾。隨后我們細致地研究了IFN-λ1/3嵌合體的活性和穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)PEG-analog-6誘導ISRE-luciferase報告基因表達的效率高于Ⅰ型干擾素PEG-IFN-α2a。PEG-analog-6和PEG-analog-7可以有效抑制丙型肝炎病毒和A型流感病毒的復制。并且PEG-analog-6和PEG-analog-7抑制流感病毒H3N2的效率高于Ⅰ型干擾素PEG-IFN-α2a。PEG-analog-6還可以抑制肺癌細胞株HCC827的增殖,誘導HCC827細胞STAT1磷酸化。此外還發(fā)現(xiàn)PEG-analog-6可以誘導HCC827細胞表達APOBEC3G。本文采用同家族基因序列置換的方法設計嵌合體蛋白質,并且證明了所設計的嵌合體蛋白質生物活性獲得顯著提高。此蛋白質設計方法避免了引入非天然蛋白質序列所引起的免疫源性問題,可用于設計和篩選安全有效的蛋白質工程藥物。本文的實驗結果如下:1.通過將Ⅲ型干擾素不同亞型之間的序列進行置換的方法設計干擾素嵌合體,并進行表達純化。發(fā)現(xiàn)以IFN-λ1序列為N端的嵌合體可以在大腸桿菌里高效表達和純化,而以IFN-λ3序列為N端的嵌合體則不能在大腸桿菌里表達。開發(fā)了一整套嵌合體干擾素的表達純化和修飾的工藝。2.通過檢測經嵌合體干擾素處理的Hep G2細胞Mx A和OAS的表達,證實4種嵌合體干擾素具有誘導干擾素應答基因表達的活性。其活性與濃度呈正相關,并且具有時間效應。3.通過檢測干擾素信號通路關鍵蛋白STAT1的磷酸化與否,證實嵌合體干擾素可以誘導STAT1發(fā)生磷酸化,從而誘導干擾素應答基因的表達。4.通過ISRE-luciferase報告基因細胞系定量研究嵌合體干擾素的活性,證實analog-6和analog-7的活性高于IFN-λ1,PEG-analog-6的活性比PEG-IFN-α2a高5倍,PEG-analog-7的活性與PEG-IFN-α2a接近。5.通過免疫熒光染色和實時定量PCR的方法證明了PEG-analog-6和PEG-analog-7嵌合體干擾素能夠抑制丙型肝炎病毒復制,其活性與PEG-IFN-α2a接近。6.通過ELISA的方法證實PEG-analog-6和PEG-analog-7嵌合體干擾素能夠抑制流感病毒的復制,并且PEG-analog-6的活性高于PEG-IFN-α2a。7.通過檢測放置于40℃的不同批次的嵌合體干擾素PEG-analog-6的濃度和純度變化的方法,證明PEG-analog-6蛋白具有高度的穩(wěn)定性。8.通過測定嵌合體干擾素對不同腫瘤細胞增殖的作用,發(fā)現(xiàn)嵌合體干擾素PEG-analog-6可以抑制肺癌細胞HCC827的增殖,誘導HCC827細胞凋亡,表達APBOEC3G。因此證實了嵌合體干擾素PEG-analog-6具有抑制腫瘤細胞增殖的活性,其活性高于PEG-IFN-λ1。本文研究結果表明嵌合體干擾素PEG-analog-6具有易于在大腸桿菌中表達和純化,穩(wěn)定性好,能夠誘導干擾素應答基因的表達,具有很高的抗病毒和抑制腫瘤細胞增殖的活性,為將其開發(fā)成蛋白質藥物奠定了基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R91

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本文編號：2251942