【摘要】：目的人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)的濫用通常是由于相關用藥知識的欠缺造成的。在我國,無論是發(fā)達地區(qū)還是偏遠落后地區(qū),這種現(xiàn)象都極為常見。在大多數(shù)情況下,HSA常被國人誤認為是滋補品,癌癥患者也經(jīng)常選擇使用HSA來增強自身免疫力。然而,過度的使用HSA對化療藥物會產(chǎn)生何種影響目前尚不清楚。本研究我們希望:1、病例調(diào)查(1)調(diào)查HSA在肺癌患者中的使用情況,明確HSA在各大醫(yī)院的濫用程度。2、在細胞水平檢測化療藥物依托泊苷(etoposide,VP-16)和順鉑(cisplatin,DDP)單獨使用或分別合并過量人血清白蛋白(Exces sive Human Serum Albumin,eHSA),化療藥物藥效學的改變,并探究具體機制(1)在細胞水平檢測化療藥物VP-16和DDP單獨使用以及分別合并eHSA對人肺癌細胞敏感株A549的細胞毒性作用;(2)采用流式細胞術、細胞克隆形成實驗、細胞遷移實驗分別檢測化療藥物單獨使用或分別合并eHSA對細胞凋亡、細胞集落形成、細胞遷移的影響;(3)采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)技術檢測化療藥物單獨使用或分別合并eHSA時細胞內(nèi)藥物濃度的改變;(4)在分子水平探討eHSA影響化療藥物藥效的分子機制。3、在動物水平檢測化療藥物VP-16和DDP單獨使用以及分別合并eHSA對小鼠肺癌移植瘤療效的影響,并探究具體機制(1)檢測對照組(未處理小鼠)、化療藥物單獨用藥組及聯(lián)合eHSA用藥組在不同時間點的HSA水平。(2)監(jiān)測化療藥物單獨用藥組及聯(lián)合eHSA用藥組小鼠體重的改變;(3)監(jiān)測化療藥物單獨用藥組及聯(lián)合eHSA用藥組肺癌移植瘤重量和體積,并分析各組抑瘤率;(4)在動物水平探討eHSA改變化療藥物藥效的分子機制。方法1、病例調(diào)查(1)選擇兩所三級綜合性醫(yī)院2016年1月至2016年4月所有患者包括腫瘤中心、腫瘤內(nèi)科、腫瘤外科、呼吸內(nèi)科在內(nèi)的四個科室所有病例。根據(jù)納入標準:(1)肺癌患者;(2)使用化療藥物VP-16和DDP的其中一種或者兩者聯(lián)合使用。對符合篩查條件的100名患者進行用藥調(diào)查,調(diào)查內(nèi)容包括患者性別、年齡、腫瘤分期、血清白蛋白水平、化療藥物及HSA使用情況六個方面。2、細胞實驗(1)利用CCK-8法檢測eHSA對化療藥物的增殖抑制作用的影響稀釋VP-16至0、2.5、5、10、20μmol/L;稀釋DDP母液至0、1、5、10、15、20μmol/L的工作濃度;HSA用完全培養(yǎng)基溶解配制濃度至10、20μmol/L。進行CCK-8實驗,化療藥物作用72h后檢驗A549細胞的增殖抑制率,在細胞增殖抑制率大于50%范圍內(nèi)選擇VP-16和DDP的適宜濃度10μmol/L作為聯(lián)合用藥濃度。選取HSA聯(lián)合用藥濃度10、20μmol/L進行CCK-8實驗。根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果將實驗分為單獨用藥組:空白組、VP-16組、DDP組、HSA組;聯(lián)合用藥組:VP-16和DDP聯(lián)合10μmol/LHSA(VP-16/DDP+HSA(10μmol/L))、VP-16和DDP聯(lián)合20μmol/L的HSA(VP-16/DDP+HSA(20μmol/L))。t檢驗比較聯(lián)合用藥前后細胞增殖抑制率的差異顯著性。(2)流式細胞術(FCM)分析eHSA對化療藥物VP-16和DDP凋亡作用的影響各個藥物組分別經(jīng)藥物處理24h和48h后,Annexin V-PI染色,流式細胞儀檢測細胞凋亡率,比較各單獨用藥組與聯(lián)合用藥組細胞凋亡率差異顯著性。(3)細胞遷移實驗測定腫瘤細胞遷移率的改變各藥物組處理48h后,用transwell小室進行細胞遷移實驗,遷移時間為24h,結(jié)晶紫染色后顯微鏡下觀察各藥物處理組細胞遷移情況。(4)LC-MS/MS測定eHSA對細胞內(nèi)化療藥物濃度的影響各藥物處理組作用12h后,萃取細胞內(nèi)藥物,比較各組間細胞內(nèi)藥物濃度差別。(5)實時熒光定量PCR(Quantitative real time PCR,q RT-PCR)和免疫印跡法(Western blot)探究細胞內(nèi)的藥物敏感基因突變基因TOP2A和ERCC1m RNA-蛋白表達的改變各個藥物處理組作用72h后,提取細胞總RNA進行q RT-PCR實驗。提取總蛋白用Western blot方法在分子水平檢測藥物敏感基因突變基因ERCC1、TOP2A蛋白的表達情況。先將所有處理組用內(nèi)參的表達量進行上樣量標準化后再檢測m RNA及目的蛋白表達量,以對照組進行歸一,采用one-way ANOVA統(tǒng)計方法,根據(jù)方差是否齊性采用可信區(qū)間檢驗法或Dunnett比較各單獨用藥組m RNA和蛋白的表達與聯(lián)合用藥組間水平差異顯著性,以及t檢驗比較各聯(lián)合用藥組與對應的單獨用藥組之間m RNA和蛋白表達水平差異顯著性。(6)細胞轉(zhuǎn)染實驗進一步在分子水平探究eHSA影響化療藥物的具體機制將A549細胞(每孔150000個細胞)接種在6孔板中24小時,分別進行E RCC1/TOP2A干擾(OPTI-MEM500μL+si RNA-mate 1000pmol+對應的si RNA1000pmol)。8小時后得到RNAi A549細胞。將A549細胞和RNAi A549細胞分別用VP-16,DDP,HSA或VP-16+HSA,DDP+HSA組合處理細胞72小時,并收集用于western blot和q RT-PCR實驗。將A549細胞(每孔5000個細胞)接種到96孔板中24小時,分別分別進行ERCC1/TOP2A干擾(OPTI-MEM50μL+si RNA-mate100pmol+對應的si RN A 80pmol)。8小時后得到RNAi A549細胞。將A549細胞和RNAi A549細胞分別用VP-16,DDP,HSA或VP-16+HSA,DDP+HSA聯(lián)合處理72小時,并收集用于CCK-8實驗。3、動物實驗(1)將小鼠LLC肺癌細胞(1×107個/只)混懸于0.2m L PBS中,皮下注射于小鼠右后肢進行肺癌造模,10天后造模成功。測量小鼠體重和移植瘤體積,選擇體重和移植瘤體積相似的72只小鼠進行后續(xù)實驗,未處理組小鼠作為對照組。所有小鼠分別尾靜脈給予不同濃度的HSA(0,1,2,4g/kg/d)。給藥3天后,次日內(nèi)眥取血,檢測血清白蛋白水平。將小鼠隨機分為12組,每組6只,分別為A組:NS+NS,B組:HSA(1g/kg/d)+NS,C組:HSA(2g/kg/d)+NS,D組:HSA(4g/kg/d)+NS,E組:NS+DDP,F組:HSA(1g/kg/d)+DDP,G組:H SA(2g/kg/d)+DDP,H組:HSA(4g/kg/d)+DDP,I組:NS+VP-16,J組:HSA(1g/kg/d)+VP-16,K組:HSA(2g/kg/d)+VP-16,L組:HSA(4g/kg/d)+VP-16。第四天開始,分別給予2,10 mg/kg/d的DDP/VP-16,共給藥18天。自用藥開始,每五天測量小鼠體重,監(jiān)測化療藥物單獨用藥組及聯(lián)合eHSA用藥組小鼠體重改變。用藥結(jié)束后(第21天)次日,內(nèi)眥取血,檢測血清白蛋白水平;(2)治療期間,游標卡尺測量腫瘤的長(L)和寬(W),各組小鼠的移植瘤體積,腫瘤體積計算公式為V=L×W2;(3)剝離并剖開觀察各組移植瘤,并對各組離體移植瘤進行稱重,計算抑瘤率,分析各組eHSA聯(lián)合用藥前后兩藥的聯(lián)合效應,抑瘤率=(1-實驗組腫瘤重量/對照組腫瘤重量)×100%;(4)選擇A、C、E、G、I、K組的移植瘤檢測ERCC1和TOP2A蛋白的表達,將離體移植瘤處理后用BCA檢測試劑盒對蛋白進行定量,western blot法檢測目的蛋白含量。結(jié)果1、病例調(diào)查通過調(diào)查發(fā)現(xiàn),在符合納入范圍的100名患者中,HSA水平低于35g/L的12例患者均靜脈注射HSA 40克;高于35g/L的88例患者中,有24例靜脈注射HSA 40克,此部分患者不必要使用HSA的比例高達27.27%。2、細胞實驗(1)CCK-8檢測結(jié)果顯示eHSA減弱了VP-16和DDP對A549細胞的增殖抑制作用。VP-16/DDP+HSA(10μmol/L)的增殖抑制率分別是62.49%±1.50%/67.51%±2.58%,VP-16/DDP+HSA(20μmol/L))的增殖抑制率分別是62.10%±2.10%/64.99%±4.99%,聯(lián)合用藥組的增殖抑制率明顯低于單獨用藥組VP-16/DDP(65.20%±5.20%/(73.04%±73.0%)(P0.05);(2)流式細胞術(FCM)檢測細胞凋亡表明,eHSA單獨作用幾乎不能引起細胞凋亡(1.98%±0.59%、1.81%±0.16%),VP-16和DDP能明顯引起細胞凋亡。與VP-16和DDP單獨用藥相比,eHSA(VP-16 HSA和DDP HSA)能明顯降低細胞凋亡,并且這種弱化作用呈劑量依賴性。VP-16單獨用藥組藥物作用24/48h的細胞凋亡率分別為19.70%±0.99%/34.79%±1.92%,而聯(lián)合用藥組VP-16+HSA(10μmol/L)細胞凋亡率分別為13.21%±0.56%/29.19%±1.04%,聯(lián)合用藥組VP-16+HSA(20μmol/L)細胞凋亡率為9.89%±0.68%/22.28%±1.40%(P0.05)。DDP單獨用藥組藥物作用24/48h的細胞凋亡率為31.50%±0.95%/40.15%±0.69%,而聯(lián)合用藥組DDP+HSA(10μmol/L)細胞凋亡率為22.70%±2.21%/35.22%±0.40%,聯(lián)合用藥組DDP+HSA(20μmol/L)細胞凋亡率為17.89%±0.53%/33.28%±1.89%,三者之間差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);(3)與VP-16/DDP單獨用藥相比,合并eHSA增加了癌細胞的遷移和克隆形成率,同時降低了VP-16/DDP的細胞內(nèi)藥物濃度。Western blot和實時熒光定量PCR檢測表明eHSA增強了藥物敏感基因突變基因TOP2A和ERCC1的蛋白和m RNA表達;(4)結(jié)果表明,在A549細胞中,eHSA顯著削弱了VP-16/DDP的抑制作用。然而,在TOP2A和ERCC1 RNA干擾的A549細胞中,eHSA卻增強了D DP的抑制作用,同時對VP-16的療效不產(chǎn)生影響。在A549細胞中,與單獨用藥組相比,eHSA顯著增強TOP2A和ERCC1的m RNA表達。在RNAi A549細胞中,TOP2A和ERCC1的m RNA表達明顯降低。在A549細胞中,與單獨用藥組相比,eHSA增強了TOP2A和ERCC1的蛋白表達。在RNAi A549細胞中,TOP2A和ERCC1的蛋白表達明顯降低。這些結(jié)果表明TOP2A和ERCC1可能與A549細胞的細胞活力有關。3、動物實驗(1)在化療開始之前,小鼠血清白蛋白水平與HSA補充量呈正相關(HSA(H)HSA(M)HSA(L)NS)。使用化療藥物干預18天后,12個實驗組的血清白蛋白水平組幾乎相同,表明補充的HSA隨時間完全分解代謝。治療結(jié)束時,A~D組小鼠體重逐漸增加,E~H組和I~L組小鼠體重逐漸下降,但E組小鼠的體重略低于F、G、H。同樣,I組小鼠的體重略低于J、K、L組,但是各組之間在各個體重監(jiān)測點鼠重均值差異均沒有統(tǒng)計學差異(P0.05);(2)用藥結(jié)束后,與非化療組相比各化療組的移植瘤重量明顯降低。DDP治療組的腫瘤生長抑制率組E,F,G,H分別為44.35%,36.89%,30.92%,29.42%。VP-16處理組I,J,K,L的腫瘤生長抑制率分別為32.41%,28.78%,21.54%,19.83%。由此可以看出eHSA聯(lián)合用藥組(F、G、H組)與相對應的化療藥物單獨用藥組(E組)相比,移植瘤重量明顯增大;eHSA聯(lián)合用藥組(J、K、L組)與相對應的化療藥物單獨用藥組(E組)相比,移植瘤重量明顯增大,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);(3)用藥結(jié)束后,化療藥物單獨用藥組(E組)與eHSA聯(lián)合用藥組(F、G、H組)相比,聯(lián)合用藥組小鼠移植瘤體積有明顯增大;同樣,化療藥物單獨用藥組(I組)與eHSA聯(lián)合用藥組(J、K、L組)相比,聯(lián)合用藥組小鼠移植瘤體積有明顯增大,并且差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),說明eHSA明顯抑制了DDP和VP-16化療效果;(4)組織病理學結(jié)果表明,腫瘤組織在A~D組中表面光滑柔軟,時有潰爛發(fā)生;在E~L組中,腫瘤組織較為堅硬,表面略有不平,與A~D組相比出血更多;(5)Western blot實驗顯示與DDP/VP-16單獨用藥組相比,eHSA顯著增強ERCC1和TOP2A蛋白的表達。結(jié)論我們的研究結(jié)果表明,合并eHSA會削弱化療藥物DDP/VP-16的抗癌作用,其機制可能是通過上調(diào)ERCC1和TOP2A表達來調(diào)控的。但e HSA不利于肺癌化療的分子機制需要進行進一步探究。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：錦州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R96

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本文編號：2241767