【摘要】：目的人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)的濫用通常是由于相關(guān)用藥知識(shí)的欠缺造成的。在我國(guó),無(wú)論是發(fā)達(dá)地區(qū)還是偏遠(yuǎn)落后地區(qū),這種現(xiàn)象都極為常見(jiàn)。在大多數(shù)情況下,HSA常被國(guó)人誤認(rèn)為是滋補(bǔ)品,癌癥患者也經(jīng)常選擇使用HSA來(lái)增強(qiáng)自身免疫力。然而,過(guò)度的使用HSA對(duì)化療藥物會(huì)產(chǎn)生何種影響目前尚不清楚。本研究我們希望:1、病例調(diào)查(1)調(diào)查HSA在肺癌患者中的使用情況,明確HSA在各大醫(yī)院的濫用程度。2、在細(xì)胞水平檢測(cè)化療藥物依托泊苷(etoposide,VP-16)和順鉑(cisplatin,DDP)單獨(dú)使用或分別合并過(guò)量人血清白蛋白(Exces sive Human Serum Albumin,eHSA),化療藥物藥效學(xué)的改變,并探究具體機(jī)制(1)在細(xì)胞水平檢測(cè)化療藥物VP-16和DDP單獨(dú)使用以及分別合并eHSA對(duì)人肺癌細(xì)胞敏感株A549的細(xì)胞毒性作用;(2)采用流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)化療藥物單獨(dú)使用或分別合并eHSA對(duì)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞集落形成、細(xì)胞遷移的影響;(3)采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)技術(shù)檢測(cè)化療藥物單獨(dú)使用或分別合并eHSA時(shí)細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的改變;(4)在分子水平探討eHSA影響化療藥物藥效的分子機(jī)制。3、在動(dòng)物水平檢測(cè)化療藥物VP-16和DDP單獨(dú)使用以及分別合并eHSA對(duì)小鼠肺癌移植瘤療效的影響,并探究具體機(jī)制(1)檢測(cè)對(duì)照組(未處理小鼠)、化療藥物單獨(dú)用藥組及聯(lián)合eHSA用藥組在不同時(shí)間點(diǎn)的HSA水平。(2)監(jiān)測(cè)化療藥物單獨(dú)用藥組及聯(lián)合eHSA用藥組小鼠體重的改變;(3)監(jiān)測(cè)化療藥物單獨(dú)用藥組及聯(lián)合eHSA用藥組肺癌移植瘤重量和體積,并分析各組抑瘤率;(4)在動(dòng)物水平探討eHSA改變化療藥物藥效的分子機(jī)制。方法1、病例調(diào)查(1)選擇兩所三級(jí)綜合性醫(yī)院2016年1月至2016年4月所有患者包括腫瘤中心、腫瘤內(nèi)科、腫瘤外科、呼吸內(nèi)科在內(nèi)的四個(gè)科室所有病例。根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn):(1)肺癌患者;(2)使用化療藥物VP-16和DDP的其中一種或者兩者聯(lián)合使用。對(duì)符合篩查條件的100名患者進(jìn)行用藥調(diào)查,調(diào)查內(nèi)容包括患者性別、年齡、腫瘤分期、血清白蛋白水平、化療藥物及HSA使用情況六個(gè)方面。2、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(1)利用CCK-8法檢測(cè)eHSA對(duì)化療藥物的增殖抑制作用的影響稀釋VP-16至0、2.5、5、10、20μmol/L;稀釋DDP母液至0、1、5、10、15、20μmol/L的工作濃度;HSA用完全培養(yǎng)基溶解配制濃度至10、20μmol/L。進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn),化療藥物作用72h后檢驗(yàn)A549細(xì)胞的增殖抑制率,在細(xì)胞增殖抑制率大于50%范圍內(nèi)選擇VP-16和DDP的適宜濃度10μmol/L作為聯(lián)合用藥濃度。選取HSA聯(lián)合用藥濃度10、20μmol/L進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)。根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果將實(shí)驗(yàn)分為單獨(dú)用藥組:空白組、VP-16組、DDP組、HSA組;聯(lián)合用藥組:VP-16和DDP聯(lián)合10μmol/LHSA(VP-16/DDP+HSA(10μmol/L))、VP-16和DDP聯(lián)合20μmol/L的HSA(VP-16/DDP+HSA(20μmol/L))。t檢驗(yàn)比較聯(lián)合用藥前后細(xì)胞增殖抑制率的差異顯著性。(2)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析eHSA對(duì)化療藥物VP-16和DDP凋亡作用的影響各個(gè)藥物組分別經(jīng)藥物處理24h和48h后,Annexin V-PI染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,比較各單獨(dú)用藥組與聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率差異顯著性。(3)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)測(cè)定腫瘤細(xì)胞遷移率的改變各藥物組處理48h后,用transwell小室進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn),遷移時(shí)間為24h,結(jié)晶紫染色后顯微鏡下觀察各藥物處理組細(xì)胞遷移情況。(4)LC-MS/MS測(cè)定eHSA對(duì)細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度的影響各藥物處理組作用12h后,萃取細(xì)胞內(nèi)藥物,比較各組間細(xì)胞內(nèi)藥物濃度差別。(5)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real time PCR,q RT-PCR)和免疫印跡法(Western blot)探究細(xì)胞內(nèi)的藥物敏感基因突變基因TOP2A和ERCC1m RNA-蛋白表達(dá)的改變各個(gè)藥物處理組作用72h后,提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行q RT-PCR實(shí)驗(yàn)。提取總蛋白用Western blot方法在分子水平檢測(cè)藥物敏感基因突變基因ERCC1、TOP2A蛋白的表達(dá)情況。先將所有處理組用內(nèi)參的表達(dá)量進(jìn)行上樣量標(biāo)準(zhǔn)化后再檢測(cè)m RNA及目的蛋白表達(dá)量,以對(duì)照組進(jìn)行歸一,采用one-way ANOVA統(tǒng)計(jì)方法,根據(jù)方差是否齊性采用可信區(qū)間檢驗(yàn)法或Dunnett比較各單獨(dú)用藥組m RNA和蛋白的表達(dá)與聯(lián)合用藥組間水平差異顯著性,以及t檢驗(yàn)比較各聯(lián)合用藥組與對(duì)應(yīng)的單獨(dú)用藥組之間m RNA和蛋白表達(dá)水平差異顯著性。(6)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在分子水平探究eHSA影響化療藥物的具體機(jī)制將A549細(xì)胞(每孔150000個(gè)細(xì)胞)接種在6孔板中24小時(shí),分別進(jìn)行E RCC1/TOP2A干擾(OPTI-MEM500μL+si RNA-mate 1000pmol+對(duì)應(yīng)的si RNA1000pmol)。8小時(shí)后得到RNAi A549細(xì)胞。將A549細(xì)胞和RNAi A549細(xì)胞分別用VP-16,DDP,HSA或VP-16+HSA,DDP+HSA組合處理細(xì)胞72小時(shí),并收集用于western blot和q RT-PCR實(shí)驗(yàn)。將A549細(xì)胞(每孔5000個(gè)細(xì)胞)接種到96孔板中24小時(shí),分別分別進(jìn)行ERCC1/TOP2A干擾(OPTI-MEM50μL+si RNA-mate100pmol+對(duì)應(yīng)的si RN A 80pmol)。8小時(shí)后得到RNAi A549細(xì)胞。將A549細(xì)胞和RNAi A549細(xì)胞分別用VP-16,DDP,HSA或VP-16+HSA,DDP+HSA聯(lián)合處理72小時(shí),并收集用于CCK-8實(shí)驗(yàn)。3、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(1)將小鼠LLC肺癌細(xì)胞(1×107個(gè)/只)混懸于0.2m L PBS中,皮下注射于小鼠右后肢進(jìn)行肺癌造模,10天后造模成功。測(cè)量小鼠體重和移植瘤體積,選擇體重和移植瘤體積相似的72只小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),未處理組小鼠作為對(duì)照組。所有小鼠分別尾靜脈給予不同濃度的HSA(0,1,2,4g/kg/d)。給藥3天后,次日內(nèi)眥取血,檢測(cè)血清白蛋白水平。將小鼠隨機(jī)分為12組,每組6只,分別為A組:NS+NS,B組:HSA(1g/kg/d)+NS,C組:HSA(2g/kg/d)+NS,D組:HSA(4g/kg/d)+NS,E組:NS+DDP,F組:HSA(1g/kg/d)+DDP,G組:H SA(2g/kg/d)+DDP,H組:HSA(4g/kg/d)+DDP,I組:NS+VP-16,J組:HSA(1g/kg/d)+VP-16,K組:HSA(2g/kg/d)+VP-16,L組:HSA(4g/kg/d)+VP-16。第四天開(kāi)始,分別給予2,10 mg/kg/d的DDP/VP-16,共給藥18天。自用藥開(kāi)始,每五天測(cè)量小鼠體重,監(jiān)測(cè)化療藥物單獨(dú)用藥組及聯(lián)合eHSA用藥組小鼠體重改變。用藥結(jié)束后(第21天)次日,內(nèi)眥取血,檢測(cè)血清白蛋白水平;(2)治療期間,游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)(L)和寬(W),各組小鼠的移植瘤體積,腫瘤體積計(jì)算公式為V=L×W2;(3)剝離并剖開(kāi)觀察各組移植瘤,并對(duì)各組離體移植瘤進(jìn)行稱(chēng)重,計(jì)算抑瘤率,分析各組eHSA聯(lián)合用藥前后兩藥的聯(lián)合效應(yīng),抑瘤率=(1-實(shí)驗(yàn)組腫瘤重量/對(duì)照組腫瘤重量)×100%;(4)選擇A、C、E、G、I、K組的移植瘤檢測(cè)ERCC1和TOP2A蛋白的表達(dá),將離體移植瘤處理后用BCA檢測(cè)試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量,western blot法檢測(cè)目的蛋白含量。結(jié)果1、病例調(diào)查通過(guò)調(diào)查發(fā)現(xiàn),在符合納入范圍的100名患者中,HSA水平低于35g/L的12例患者均靜脈注射HSA 40克;高于35g/L的88例患者中,有24例靜脈注射HSA 40克,此部分患者不必要使用HSA的比例高達(dá)27.27%。2、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(1)CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示eHSA減弱了VP-16和DDP對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用。VP-16/DDP+HSA(10μmol/L)的增殖抑制率分別是62.49%±1.50%/67.51%±2.58%,VP-16/DDP+HSA(20μmol/L))的增殖抑制率分別是62.10%±2.10%/64.99%±4.99%,聯(lián)合用藥組的增殖抑制率明顯低于單獨(dú)用藥組VP-16/DDP(65.20%±5.20%/(73.04%±73.0%)(P0.05);(2)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡表明,eHSA單獨(dú)作用幾乎不能引起細(xì)胞凋亡(1.98%±0.59%、1.81%±0.16%),VP-16和DDP能明顯引起細(xì)胞凋亡。與VP-16和DDP單獨(dú)用藥相比,eHSA(VP-16 HSA和DDP HSA)能明顯降低細(xì)胞凋亡,并且這種弱化作用呈劑量依賴(lài)性。VP-16單獨(dú)用藥組藥物作用24/48h的細(xì)胞凋亡率分別為19.70%±0.99%/34.79%±1.92%,而聯(lián)合用藥組VP-16+HSA(10μmol/L)細(xì)胞凋亡率分別為13.21%±0.56%/29.19%±1.04%,聯(lián)合用藥組VP-16+HSA(20μmol/L)細(xì)胞凋亡率為9.89%±0.68%/22.28%±1.40%(P0.05)。DDP單獨(dú)用藥組藥物作用24/48h的細(xì)胞凋亡率為31.50%±0.95%/40.15%±0.69%,而聯(lián)合用藥組DDP+HSA(10μmol/L)細(xì)胞凋亡率為22.70%±2.21%/35.22%±0.40%,聯(lián)合用藥組DDP+HSA(20μmol/L)細(xì)胞凋亡率為17.89%±0.53%/33.28%±1.89%,三者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(3)與VP-16/DDP單獨(dú)用藥相比,合并eHSA增加了癌細(xì)胞的遷移和克隆形成率,同時(shí)降低了VP-16/DDP的細(xì)胞內(nèi)藥物濃度。Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)表明eHSA增強(qiáng)了藥物敏感基因突變基因TOP2A和ERCC1的蛋白和m RNA表達(dá);(4)結(jié)果表明,在A549細(xì)胞中,eHSA顯著削弱了VP-16/DDP的抑制作用。然而,在TOP2A和ERCC1 RNA干擾的A549細(xì)胞中,eHSA卻增強(qiáng)了D DP的抑制作用,同時(shí)對(duì)VP-16的療效不產(chǎn)生影響。在A549細(xì)胞中,與單獨(dú)用藥組相比,eHSA顯著增強(qiáng)TOP2A和ERCC1的m RNA表達(dá)。在RNAi A549細(xì)胞中,TOP2A和ERCC1的m RNA表達(dá)明顯降低。在A549細(xì)胞中,與單獨(dú)用藥組相比,eHSA增強(qiáng)了TOP2A和ERCC1的蛋白表達(dá)。在RNAi A549細(xì)胞中,TOP2A和ERCC1的蛋白表達(dá)明顯降低。這些結(jié)果表明TOP2A和ERCC1可能與A549細(xì)胞的細(xì)胞活力有關(guān)。3、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(1)在化療開(kāi)始之前,小鼠血清白蛋白水平與HSA補(bǔ)充量呈正相關(guān)(HSA(H)HSA(M)HSA(L)NS)。使用化療藥物干預(yù)18天后,12個(gè)實(shí)驗(yàn)組的血清白蛋白水平組幾乎相同,表明補(bǔ)充的HSA隨時(shí)間完全分解代謝。治療結(jié)束時(shí),A~D組小鼠體重逐漸增加,E~H組和I~L組小鼠體重逐漸下降,但E組小鼠的體重略低于F、G、H。同樣,I組小鼠的體重略低于J、K、L組,但是各組之間在各個(gè)體重監(jiān)測(cè)點(diǎn)鼠重均值差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);(2)用藥結(jié)束后,與非化療組相比各化療組的移植瘤重量明顯降低。DDP治療組的腫瘤生長(zhǎng)抑制率組E,F,G,H分別為44.35%,36.89%,30.92%,29.42%。VP-16處理組I,J,K,L的腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為32.41%,28.78%,21.54%,19.83%。由此可以看出eHSA聯(lián)合用藥組(F、G、H組)與相對(duì)應(yīng)的化療藥物單獨(dú)用藥組(E組)相比,移植瘤重量明顯增大;eHSA聯(lián)合用藥組(J、K、L組)與相對(duì)應(yīng)的化療藥物單獨(dú)用藥組(E組)相比,移植瘤重量明顯增大,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(3)用藥結(jié)束后,化療藥物單獨(dú)用藥組(E組)與eHSA聯(lián)合用藥組(F、G、H組)相比,聯(lián)合用藥組小鼠移植瘤體積有明顯增大;同樣,化療藥物單獨(dú)用藥組(I組)與eHSA聯(lián)合用藥組(J、K、L組)相比,聯(lián)合用藥組小鼠移植瘤體積有明顯增大,并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說(shuō)明eHSA明顯抑制了DDP和VP-16化療效果;(4)組織病理學(xué)結(jié)果表明,腫瘤組織在A~D組中表面光滑柔軟,時(shí)有潰爛發(fā)生;在E~L組中,腫瘤組織較為堅(jiān)硬,表面略有不平,與A~D組相比出血更多;(5)Western blot實(shí)驗(yàn)顯示與DDP/VP-16單獨(dú)用藥組相比,eHSA顯著增強(qiáng)ERCC1和TOP2A蛋白的表達(dá)。結(jié)論我們的研究結(jié)果表明,合并eHSA會(huì)削弱化療藥物DDP/VP-16的抗癌作用,其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)ERCC1和TOP2A表達(dá)來(lái)調(diào)控的。但e HSA不利于肺癌化療的分子機(jī)制需要進(jìn)行進(jìn)一步探究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2241767