【摘要】：研究目的：肝細(xì)胞癌(HCC)是全球癌癥中致死率較高的一種惡性腫瘤,在中國HCC的發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢。目前臨床上用于治療肝癌的藥物主要有索拉菲尼、舒尼替尼、貝伐單抗、西羅莫司等,但這些藥物單獨(dú)治療晚期肝癌的效果依然十分有限,新的藥物治療策略亟待開發(fā)。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑是一類臨床具有廣譜抗腫瘤作用的藥物,在體外具有非常強(qiáng)的抗肝癌活性,但其在肝癌臨床治療中療效有限。目前對引起體內(nèi)外之間巨大差異的機(jī)制還尚不清楚。肝癌微環(huán)境中氧壓較其他實(shí)體瘤更低,本研究結(jié)果表明低氧環(huán)境下HIF-1α的高表達(dá)是引起人肝癌對拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑敏感性降低的重要因素之一。Tirapazamine (TPZ)是一種低氧選擇性藥物,課題組前期實(shí)驗(yàn)成果發(fā)現(xiàn)其在低氧下可抑制HIF-1α蛋白的合成。本文將研究TPZ和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑合用在體內(nèi)外人肝癌中的抗腫瘤活性,并探討其合用的具體機(jī)制。 研究方法：(1)SRB法檢測在5種不同的人肝癌細(xì)胞株和1種正常的人肝細(xì)胞中TPZ和四種拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑(SN-38、TPT、HCPT、MONCPT)聯(lián)合用藥抑制人腫瘤細(xì)胞增殖的能力,并計(jì)算了合用指數(shù)(CI)。(2)利用shRNA技術(shù)沉默HIF-1α基因表達(dá)。(3) Western Blotting法檢測體內(nèi)外相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。(4)雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測HIF-1α轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性。(5)克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測TPZ和四種拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑聯(lián)合用藥的抗肝癌活性。(6)建立人源性腫瘤裸小鼠Bel-7402移植瘤模型,檢測TPZ和CPT-11(SN-38前藥)合用對裸小鼠移植瘤的實(shí)驗(yàn)治療作用。(7) DAPI染色法檢測給藥前后人肝癌細(xì)胞中凋亡小體的產(chǎn)生情況。(8)PI單染或Annexin-V/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)來檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。(9)利用JC-1染色法檢測線粒體膜電位的變化情況。(10)免疫熒光法檢測蛋白在細(xì)胞或組織內(nèi)的分布和表達(dá)情況。(11)熒光實(shí)時定量PCR法檢測mRNA的表達(dá)。(12)免疫組化法檢測瘤組織切片中蛋白的分布及表達(dá)情況。(13)利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白的表達(dá)。 研究結(jié)果：(1) Tirapazamine與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑在人肝癌中合用的藥效學(xué)研究：實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在人肝癌中存在拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑低氧敏感性降低的現(xiàn)象,而HIF-1α在其中起了關(guān)鍵的作用。TPZ在人肝癌細(xì)胞中也可抑制低氧下HIF-1α蛋白的累積。在多株人肝癌細(xì)胞中(HepG-2、Bel-7402、Hep3B、Huh7和SMMC-7721)TPZ與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑都可協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,合用指數(shù)均在0.7以下。而在正常的人肝細(xì)胞中,兩者合用并未產(chǎn)生協(xié)同作用。同時,TPZ與CPT-11合用在人肝癌Bel-7402移植瘤裸小鼠模型上也表現(xiàn)出顯著的協(xié)同實(shí)驗(yàn)治療作用,且未引起動物體重顯著下降。 (2) Tirapazamine與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑在人肝癌中發(fā)揮協(xié)同作用的機(jī)制研究： 在人肝癌中TPZ與SN-38(CPT-11的主要活性代謝產(chǎn)物)合用可協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡,兩者通過降低線粒體的膜電位,激活Caspase-3的裂解,引起PARP的切割,最終誘導(dǎo)人肝癌Bel-7402細(xì)胞發(fā)生凋亡。TPZ與SN-38合用能夠協(xié)同降低HIF-1α蛋白的合成速率,抑制HIF-1α蛋白的表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄活性。而HIF-1α表達(dá)水平的下調(diào)會導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)水平的降低,引起細(xì)胞內(nèi)DNA損傷的大量累積。RAD51、Chk1磷酸化水平的降低提示RAD51介導(dǎo)的同源重組修復(fù)通路在這過程中扮演了重要的角色。結(jié)論：(1)HIF-1α是介導(dǎo)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑在人肝癌中低氧敏感性降低的關(guān)鍵因素。TPZ與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑合用可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡,抑制體內(nèi)外腫瘤的增殖,發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。 (2)在TPZ與SN-38合用過程中HIF-1α蛋白的降低是關(guān)鍵因素,其產(chǎn)生協(xié)同作用的機(jī)制是：通過協(xié)同抑制HIF-1α的蛋白合成途徑,引起HIF-1α蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性的下調(diào),抑制了Rad51介導(dǎo)的同源重組修復(fù)通路,導(dǎo)致藥物引起的DNA損傷在細(xì)胞內(nèi)大量累積,最終誘導(dǎo)細(xì)胞走向凋亡。
[Abstract]:Objective: Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most lethal cancers in the world. The incidence of HCC in China is increasing year by year. At present, the main drugs used to treat hepatocellular carcinoma are sorafenib, sunitinib, bevacizumab, sirolimus and so on. Topoisomerase I inhibitors are a class of drugs with broad-spectrum anti-tumor effect in clinic and have very strong anti-hepatoma activity in vitro. However, their efficacy in clinical treatment of hepatocellular carcinoma is limited. Tirapazamine (TPZ) is a hypoxic selective drug. Previous studies have shown that it can inhibit the synthesis of HIF-1a protein under hypoxia. In this paper, the antitumor activity of TPZ and topoisomerase I inhibitors in human hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo was studied, and the specific mechanism of their combination was discussed.
Methods: (1) SRB assay was used to detect the ability of TPZ and four topoisomerase I inhibitors (SN-38, TPT, HCPT, MONCPT) to inhibit the proliferation of human hepatoma cells in 5 different human hepatoma cell lines and 1 normal human hepatocytes, and the co-use index (CI) was calculated. (2) HIF-1a gene expression was silenced by shRNA technique. (3) Western Blotti. The expression of related proteins in vivo and in vitro was detected by ng method. (4) The transcriptional activity of HIF-1 alpha transcription factor was detected by double luciferase reporter gene technique. (5) The anti-hepatoma activity of TPZ combined with four topoisomerase I inhibitors was detected by cloning formation assay. (6) The human tumor model of Bel-7402 transplanted in nude mice was established, and TPZ and CPT-11 (S) were detected. (7) DAPI staining was used to detect the production of apoptotic bodies in human hepatoma cells before and after administration. (8) PI single staining or Annexin-V/PI double staining combined with flow cytometry was used to detect the occurrence of apoptosis. (9) JC-1 staining was used to detect the changes of mitochondrial membrane potential. (10) Immunoassay. Fluorescence assay was used to detect the distribution and expression of proteins in cells or tissues. (11) Real-time quantitative PCR was used to detect the expression of mRNA. (12) Immunohistochemistry was used to detect the distribution and expression of proteins in tumor tissues. (13) The expression of HIF-1a protein in cells was amplified by plasmid transfection.
Results: (1) Pharmacodynamics of Tirapazamine and Topoisomerase I Inhibitor in Human Hepatocellular Carcinoma: The results showed that the hypoxia sensitivity of topoisomerase I inhibitor was decreased in human hepatocellular carcinoma, and HIF-1a played a key role in it. TPZ could also inhibit HIF-1a protein in human hepatocellular carcinoma cells under hypoxia. TPZ and topoisomerase I inhibitors in several human hepatoma cells (HepG-2, Bel-7402, Hep3B, Huh 7 and SMMC-7721) could synergistically inhibit the proliferation of tumor cells with a combined index below 0.7. In normal human hepatocytes, the combination of TPZ and CPT-11 did not produce synergistic effects. At the same time, TPZ and CPT-11 were combined in human hepatoma Bel-7402 transplantation. The tumor nude mice model also showed significant synergistic experimental effect, and did not cause significant weight loss.
(2) the synergistic effect of Tirapazamine and topoisomerase I inhibitor in human hepatocellular carcinoma.
TPZ combined with SN-38 (the main active metabolite of CPT-11) can induce apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells. TPZ and SN-38 can induce apoptosis of human hepatocellular carcinoma Bel-7402 cells by lowering the membrane potential of mitochondria, activating the cleavage of Caspase-3 and inducing the cleavage of PARP. Inhibition of HIF-1a protein expression and transcriptional activity. The down-regulation of HIF-1a expression may result in a decrease in DNA damage repair and accumulation of DNA damage in cells. The decrease of RAD51 and Chk1 phosphorylation suggests that RAD51-mediated homologous recombinant repair pathway plays an important role in this process. TPZ combined with topoisomerase I inhibitor can induce apoptosis of hepatocellular carcinoma cells, inhibit tumor proliferation in vivo and in vitro, and play a synergistic anti-tumor role.
(2) The decrease of HIF-1a protein is a key factor in the combination of TPZ and SN-38. The synergistic mechanism of HIF-1a protein synthesis is that HIF-1a protein expression and transcriptional activity are down-regulated by synergistic inhibition of HIF-1a protein synthesis pathway, which inhibits Rad51-mediated homologous recombinant repair pathway and leads to a large number of DNA damage in cells. Accumulation eventually induces cell apoptosis.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R735.7;R96

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2233436