【摘要】：煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(NAMPT,Nicotinamide phosphoribosyltransferase),主要由491個(gè)氨基酸組成,其分子量為55 k Da,晶體結(jié)構(gòu)顯示為二聚體形式存在的II型磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶。NAMPT具有廣泛的生物學(xué)功能,除了調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞分化成熟、促進(jìn)前B細(xì)胞增殖分化、參與機(jī)體炎癥反應(yīng)、抑制中性粒細(xì)胞凋亡等作用外,其最主要的功能就是作為生物體內(nèi)NAD合成的限速酶。近年來(lái)大量研究表明,NAMPT是一種很有前景的抗腫瘤靶點(diǎn),在多種腫瘤細(xì)胞中NAMPT為過(guò)表達(dá)的并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展都成正相關(guān)性;與此同時(shí),在腦卒中的保護(hù)中,NAMPT也是至關(guān)重要的,其直接產(chǎn)物NMN對(duì)于腦卒中有很好的保護(hù)作用。因此,開發(fā)基于NAMPT為靶點(diǎn)的小分子抑制劑和激活劑,對(duì)治療腫瘤和腦卒中都起著至關(guān)重要的作用,而目前針對(duì)于NAMPT的小分子化合物的開發(fā)還處在起步階段,對(duì)于研發(fā)臨床藥物而言,仍需要大量結(jié)構(gòu)多樣的NAMPT小分子化合物作為基礎(chǔ)。本論文以開發(fā)新型結(jié)構(gòu)NAMPT抑制劑和激活劑為主要研究方向,以基于NAMPT為靶點(diǎn)的高通量篩選檢測(cè)技術(shù)為研究手段,著重進(jìn)行全新結(jié)構(gòu)的NAMPT抑制劑和激活劑的發(fā)現(xiàn)、優(yōu)化及其機(jī)制研究。一、基于非Chemdiv化合物庫(kù)進(jìn)行抑制劑的篩選、化合物優(yōu)化及其機(jī)制研究應(yīng)用基于NAMPT特異性靶點(diǎn)的高通量篩選檢測(cè)技術(shù),我們獲得了一個(gè)活性很好的NAMPT抑制劑MSO(中國(guó)專利號(hào):ZL201110447488.9),其體外離體酶活性為(IC50=9.87±1.15 n M),并且能夠抑制包括腫瘤干細(xì)胞樣的多種腫瘤細(xì)胞的增殖。我們對(duì)MSO經(jīng)過(guò)構(gòu)效分析研究后,合成了一系列高活性的MSO結(jié)構(gòu)類似物。這些抑制劑能夠特異性地結(jié)合NAMPT,而不是其下游靶點(diǎn)NMNAT。我們首次提供了一個(gè)化學(xué)實(shí)例,應(yīng)用新近報(bào)道的細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移分析技術(shù),分析了化合物在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外造成活性差異的原因,例如由于MS7化合物在活體細(xì)胞中的靶點(diǎn)富集作用很差,使得其在體外離體酶活性實(shí)驗(yàn)中顯示出了最好活性(IC50=0.93±0.29 n M),但是在細(xì)胞水平上其活性很差。通過(guò)對(duì)NAMPT活性酶的點(diǎn)突變研究以及晶體的培養(yǎng),我們確認(rèn)了抑制劑的結(jié)合模式及其重要的作用氨基酸殘基。本研究為更深層次地了解NAMPT抑制劑分子作用模式和未來(lái)的抗腫瘤藥物研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。二、基于Chemdiv化合物庫(kù)進(jìn)行抑制劑的篩選及其機(jī)制研究在研發(fā)抗腫瘤藥物中,需要大量新型的結(jié)構(gòu)多樣的NAMPT抑制劑。在使用基于NAMPT靶點(diǎn)的高通量篩選檢測(cè)平臺(tái)時(shí),針對(duì)于有3萬(wàn)個(gè)化合物組成的Chemdiv化合物庫(kù)進(jìn)行篩選,我們發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)活性較好的化合物,分別是非熒光性化合物F671-0003(IC50=85.05±6.42 n M)和熒光性化合物M049-0244(IC50=170±12 n M)。這兩種化合物能夠有效地抑制Hep G2細(xì)胞系的增殖,并且顯著地降低細(xì)胞內(nèi)NAD水平。外源性地加入NMN,能夠補(bǔ)救對(duì)于HepG2的增殖抑制作用。構(gòu)效分析的研究結(jié)果顯示了化合物F671-0003的分子作用模式,并且發(fā)現(xiàn)氫鍵作用力,疏水性作用力和π-π作用力對(duì)于化合物的結(jié)合是非常重要的。另一方面,成像研究顯示了熒光性化合物M049-0244在3μM的濃度下,能夠顯著地染色HepG2中的NAMPT,并且在經(jīng)過(guò)4 h后,仍能夠檢測(cè)到熒光。我們通過(guò)RNA干擾技術(shù)和對(duì)NAMPT過(guò)表達(dá)小鼠的研究,確認(rèn)了該化合物的熒光特異性。本部分研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)具有全新結(jié)構(gòu)類型的抗腫瘤先導(dǎo)化合物,并且首次應(yīng)用熒光探針進(jìn)行NAMPT檢測(cè)。三、基于化合物庫(kù)進(jìn)行NAMPT潛在激活劑的篩選及其機(jī)制研究應(yīng)用基于NAMPT為靶點(diǎn)的高通量篩選檢測(cè)平臺(tái)對(duì)Chemdiv化合物和非Chemdiv化合物兩個(gè)化合物庫(kù)進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)有潛在激活NAMPT作用的化合物共495個(gè),通過(guò)初篩復(fù)篩最終選出4類結(jié)構(gòu)類型的化合物,對(duì)NAMPT有潛在的激活作用,可以作為研發(fā)NAMPT激活劑的備選化合物。綜上所述,本研究針對(duì)由54434個(gè)小分子化合物組成的化合物庫(kù),應(yīng)用自主建立的基于NAMPT為靶點(diǎn)的高通量檢測(cè)技術(shù),對(duì)NAMPT小分子化合物進(jìn)行了高通量篩選,在抑制劑方面選出了多個(gè)系列新型NAMPT抑制劑,特別是,具有全新結(jié)構(gòu)類型的化合物MSO和具有NAMPT熒光探針作用的化合物M049-0244,并以MSO為基本結(jié)構(gòu),合成優(yōu)化了46個(gè)結(jié)構(gòu)類似物,深入探討了他們的構(gòu)效關(guān)系和分子機(jī)制;在潛在NAMPT激活劑篩選方面,選出了4類結(jié)構(gòu)可作為研發(fā)NAMPT激活劑的備選化合物。本論文NAMPT小分子活性化合物的發(fā)現(xiàn)及進(jìn)一步作用機(jī)制的研究,為未來(lái)的抗腫瘤藥物和腦卒中保護(hù)藥物的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) is composed of 491 amino acids with a molecular weight of 55 K Da. The crystal structure of NAMPT is a dimer type II phosphoribosyltransferase. NAMPT has a wide range of biological functions, in addition to regulating lipid metabolism and promoting vascular smooth muscle cell differentiation. In recent years, a large number of studies have shown that NAMPT is a promising anti-tumor target. In many tumor cells, NAMPT is overexpressed and associated with tumors. At the same time, NAMPT is also very important in the protection of stroke, and its direct product NMN has a very good protective effect on stroke. Therefore, the development of small molecule inhibitors and activators targeting NAMPT plays a vital role in the treatment of cancer and stroke, and currently targeted at The development of small molecule compounds of NAMPT is still in its infancy. For the development of clinical drugs, a large number of small molecule compounds of NAMPT with various structures are still needed as the basis. Meanwhile, we focused on the discovery, optimization and mechanism of novel NAMPT inhibitors and activators. First, based on the non-Chemdiv compound library, we screened inhibitors, optimized compounds and their mechanisms. Using high throughput screening and detection technology based on NAMPT specific targets, we obtained a NAMPT inhibitor M with good activity. SO (China Patent No. It is the downstream target NMNAT. We provide a chemical example for the first time. Using the recently reported technique of cell heat transfer analysis, we analyzed the reasons for the difference in activity between intracellular and extracellular compounds. The best activity was shown (IC50 = 0.93 + 0.29 n M), but its activity was poor at the cellular level. Through the study of point mutation of NAMPT enzyme and crystal culture, we confirmed the binding pattern of inhibitors and their important functional amino acid residues. This study is to understand the molecular action pattern and future of NAMPT inhibitors in a deeper level. Second, a large number of novel NAMPT inhibitors are needed in the development of anti-tumor drugs based on the Chemdiv compound library. Chemdiv chelation of 30,000 compounds is used in the high throughput screening platform based on NAMPT target. Two compounds with better activity, F671-0003 (IC50 = 85.05 (+6.42 n M)) and M049-0244 (IC50 = 170 (+12 n M)), were found to inhibit the proliferation of Hep G2 cell lines and significantly reduce the intracellular NAD level. The results of structure-activity analysis showed that the molecular interaction mode of compound F671-0003 and the hydrogen bonding force, hydrophobic force and pi-pi force were very important for the binding of the compounds. On the other hand, imaging studies showed that the fluorescent compound M049-0244 was at 3 mu M. NAMPT in HepG2 can be stained significantly at the concentration of NAMPT, and fluorescence can still be detected after 4 hours. The fluorescence specificity of the compound was confirmed by RNA interference technique and NAMPT overexpression in mice. NAMPT detection using fluorescent probes. 3. Screening of potential NAMPT activators based on compound libraries and their mechanisms; screening of hemdiv compounds and non-Chemdiv compounds libraries using a high throughput screening platform based on NAMPT as a target. A total of 495 compounds with potential NAMPT activation were found. In summary, this study aimed at the compound library composed of 54434 small molecule compounds, and applied the self-established high-throughput detection technology based on NAMPT as the target to small molecule NAMPT. A series of novel NAMPT inhibitors were selected, especially compounds MSO with novel structure and M049-0244 with NAMPT fluorescence probe. Forty-six structural analogues were synthesized and optimized with MSO as the basic structure. Their structure-activity relationship and composition were discussed in detail. In this paper, the discovery of NAMPT small molecule active compounds and the further study of the mechanism of action have laid the foundation for the future development of anti-tumor drugs and stroke protective drugs.
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R91

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本文編號(hào)：2224398