【摘要】：研究背景：目前在生物制藥中用到的生物反應(yīng)器包括細菌表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)和植物表達系統(tǒng),其中植物生物反應(yīng)器以其技術(shù)操作簡單、安全環(huán)保、經(jīng)濟成本低、不攜帶病原等優(yōu)勢越來越受到人們的關(guān)注。部分植物源藥用蛋白已開始進入市場。但是植物中外源蛋白表達量低和不能表達高度人源化糖蛋白,限制了它的應(yīng)用和發(fā)展。目前的生物藥品主要是多肽和蛋白類藥物,其中一些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的藥物蛋白,一方面難以準確定位到靶點位置,另一方面存在空間位阻,不能與靶點高效結(jié)合發(fā)揮功能。因此,近年來核酸類小分子藥物開始嶄露頭角,尤其是RNA干擾治療中使用的干擾小RNA。RNA干擾(RNA interference, RNAi)中常用的干擾小RNA可分為siRNA(short interfering RNA) 和 miRNA (microRNA),前者為外源性,后者為內(nèi)源性。但是二者功能一致,通過序列互補,特異性地識別靶基因mRNA使其降解或翻譯抑制,從而“沉默”基因表達,這在細胞的基本活動中扮演著重要角色。RNAi在基因治療研究中有著獨特的優(yōu)勢：與傳統(tǒng)藥物相比,RNAi藥物在疾病治療中具有高效性、特異性、低毒性和可傳遞性等優(yōu)點。目前RNAi治療中使用的干擾小RNA主要由化學(xué)方法合成,由于其不穩(wěn)定、易降解等特性,需要一定的化學(xué)修飾,導(dǎo)致化學(xué)合成的siRNA成本較高。另外一個限制RNAi藥物臨床應(yīng)用的主要因素是RNAi藥物在體內(nèi)的輸送,即如何將藥物靶向輸送到特定的病灶組織或器官。2011年,我校研究團隊在Cell Research發(fā)表的研究結(jié)果顯示：在哺乳動物血清中可檢測出多種植物內(nèi)源miRNA,其中miR168a可特異性靶向小鼠基因下調(diào)其肝臟中LDLRAP1的表達,從而說明食物來源的植物miRNA可能有跨界調(diào)控哺乳動物基因表達的作用。研究目的與意義：基于以上研究成果,我們提出利用植物表達有治療功能的干擾小RNA,以望通過食物攝入的方式進入人或動物體內(nèi),發(fā)揮基因沉默的功能,達到基因治療的效果。這項研究不僅解決了目前RNAi在基因治療中遇到的問題,而且拓展了植物生物反應(yīng)器在生物制藥中的應(yīng)用空間。研究方法與結(jié)果：本課題以HCV (hepatitis C Virus)基因組以及與2型糖尿病密切相關(guān)的PGC1αa mRNA為靶點,依據(jù)序列互補原則設(shè)計了藥用干擾小RNA或稱人造小RNA (artificial microRNA)的序列。然后構(gòu)建表達載體質(zhì)粒,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)將其轉(zhuǎn)入生菜,用RT-PCR和Northern blot的方法對轉(zhuǎn)化再生植株中干擾小RNA的表達進行分子鑒定。結(jié)果成功獲得了陽性轉(zhuǎn)化再生植株。但是還需后續(xù)動物實驗或臨床試驗來驗證生菜表達干擾小RNA的基因沉默效果和RNA干擾治療效果。
[Abstract]:Background: bioreactors used in biopharmaceuticals include bacterial expression system, yeast expression system, insect cell expression system, mammalian cell expression system and plant expression system. Among them, plant bioreactor has attracted more and more attention because of its advantages of simple operation, safe and environmental protection, low economic cost and no pathogen. Some plant-derived medicinal proteins have begun to enter the market. However, the low expression of exogenous proteins in plants and their inability to express highly humanized glycoproteins limit its application and development. At present, biopharmaceuticals are mainly polypeptide and protein drugs, some of which have complex structure. On the one hand, it is difficult to locate the target position accurately, on the other hand, there is a space resistance, so it can not function efficiently with the target. Therefore, in recent years, nucleic acid small molecular drugs have begun to emerge, especially in the treatment of RNA interference small RNA.RNA interference (RNA interference, RNAi) commonly used interference small RNA can be divided into siRNA (short interfering RNA) and miRNA (microRNA), the former is exogenous, the latter is endogenous. But they have the same function. They can specifically recognize the target gene mRNA to degrade or inhibit their translation through sequence complementation, thus "silencing" gene expression. RNAi plays an important role in the basic activities of cells. RNAi has unique advantages in gene therapy: compared with traditional drugs, RNAi has the advantages of high efficiency, specificity, low toxicity and transmissibility in the treatment of diseases. At present, the small interfering RNA used in the treatment of RNAi is mainly synthesized by chemical method. Because of its unstable and degradable properties, it needs some chemical modification, which leads to the high cost of siRNA synthesis. Another major limiting factor in the clinical use of RNAi drugs is the delivery of RNAi drugs in vivo, that is, how to target the delivery of drugs to specific lesion tissues or organs. The results of the study published by our team in Cell Research showed that multiple plant endogenous miRNA, could be detected in mammalian serum in which miR168a could specifically target mouse genes to down-regulate the expression of LDLRAP1 in the liver. It is suggested that miRNA from food source may have the function of regulating mammalian gene expression in a cross-border manner. Objective and significance: based on the above research results, we propose to use plant expressed interference small RNA, to enter human or animal body through food intake, to play the role of gene silencing, and to achieve the effect of gene therapy. This study not only solves the problems encountered by RNAi in gene therapy, but also expands the application space of plant bioreactor in biopharmaceuticals. Methods and results: using HCV (hepatitis C Virus) genome and PGC1 偽 a mRNA closely related to type 2 diabetes mellitus as targets, the sequence of small interfering RNA or artificial small RNA (artificial microRNA) was designed according to the principle of sequence complementarity. Then the expression vector plasmid was constructed and transformed into lettuce by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. The expression of interfering small RNA in regenerated plants was identified by RT-PCR and Northern blot. Results the positive transformed plants were successfully obtained. But further animal experiments or clinical trials are needed to verify the gene silencing effect of lettuce expression interfering small RNA and the therapeutic effect of RNA interference.
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R915;Q789

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本文編號：2218156