【摘要】：納米載體作為基因藥物的有效遞送系統(tǒng)自問世以來吸引大批科研人員的關(guān)注,然而在過去的50年里一直發(fā)展緩慢,主要?dú)w結(jié)于納米制劑制備技術(shù)的落后。傳統(tǒng)的制備技術(shù)重現(xiàn)性差,操作繁瑣復(fù)雜,缺乏精確可控等缺點(diǎn)導(dǎo)致制備的納米載體分散性差,批次差異大,嚴(yán)重的限制了納米醫(yī)學(xué)的發(fā)展。現(xiàn)如今,可控性好、重現(xiàn)性高、穩(wěn)定性好的微流控技術(shù)已開始用于納米載體的生產(chǎn)制備過程中,提高制備效率、縮短制備時間、簡化操作工序并制備出分散均一狹小的納米顆粒。本論文將陽離子脂質(zhì)與聚乙烯亞胺聯(lián)合應(yīng)用構(gòu)建多聚物-脂質(zhì)復(fù)合納米載體(Polymer-lipid hybrid nanoparticles,P/LNPs),并設(shè)計兩種微流控芯片(MF1,MF2)制備P/LNPs(P/LNPs-MF1,P/LNPs-MF2)用于遞送VEGF siRNA,并考察P/LNPs-MF的載體穩(wěn)定性、安全性以及遞送siRNA能力,而乙醇注入方法(BM)制備的P/LNPs(P/LNPs-BM)則作為陽性對照。論文具體內(nèi)容概括如下:1.P/LNPs-MF處方組成和制備工藝優(yōu)化本文首先對微流控芯片技術(shù)制備的P/LNPs-MF進(jìn)行處方組成和制備工藝的優(yōu)化,以期制備出大小均勻分散的P/LNPs-MF。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,DODMA,EggPC,Cholesterol,PEI和DSPE-mPEG2000以40/19/35/5/1的處方比例,在0.8mg/ml的匯合流速下與siRNA混合,并經(jīng)過超聲后處理,能制備出大小合適、分布均勻、穩(wěn)定性好的P/LNPs-MF納米粒,其中以P/LNPs-MF2效果最佳,粒徑為119.8nm,PDI為0.096,電位為11.3mV,血清孵育12h后仍穩(wěn)定,4℃放置30天也不發(fā)生明顯變化,而傳統(tǒng)制法的P/LNPs-BM納米粒則粒徑較大且呈多分散性分布。2.P/LNPs-MF的體外抗腫瘤評價其次,本文對微流控芯片技術(shù)制備的載siRNA的P/LNPs-MF進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的考察,以評價P/LNPs-MF載體安全性以及遞送siRNA的轉(zhuǎn)染入胞效率、基因沉默效率和腫瘤細(xì)胞抑制效率。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各空白P/LNPs細(xì)胞存活率均在80%以上,相反地,載siRNA的P/LNPs-MF則發(fā)揮顯著的抑制作用,相比于P/LNPs-BM僅20%左右的抑制效率,P/LNPs-MF2作用48h能抑制多達(dá)50%的癌細(xì)胞活性,是前者效率的兩倍;流式細(xì)胞儀與激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示P/LNPs-MF2在A549、HepG-2和MCF-7各細(xì)胞系中細(xì)胞攝取效果最高,而P/LNPs-BM與P/LNPs-MF1的效果相似且均低于P/LNPs-MF2;qRT-RCR測定VEGF mRNA結(jié)果表示,載siRNA的P/LNPs-MF2能抑制62.2%VEGF mRNA的表達(dá),其抑制效果分別比P/LNPs-MF1與P/LNPs-BM多12.6%和19.9%;Western-blot測定VEGF蛋白結(jié)果與qRT-RCR一致,均證明了P/LNPs-MF2的基因沉默效率比P/LNPs-MF1與P/LNPs-BM更顯著。3.P/LNPs-MF的體內(nèi)抗腫瘤評價最后,本文對微流控芯片技術(shù)制備的載siRNA的P/LNPs-MF進(jìn)行體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)的考察,以評價P/LNPs-MF在體內(nèi)藥物代謝作用、腫瘤生長抑制作用、基因沉默作用以及安全毒副作用。藥代學(xué)參數(shù)結(jié)果顯示,P/LNPs-MF2避免了網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的消除作用并延長了siRNA在體內(nèi)的循環(huán)時間,這將有利于增加siRNA在腫瘤部位的積累;體內(nèi)腫瘤抑制作用結(jié)果表明,P/LNPs-MF2能抑制腫瘤體積至300mm3左右,持續(xù)給藥后腫瘤生長停滯并出現(xiàn)負(fù)增長,最終腫瘤大小縮小至0.23g,而P/LNPs-BM抑制效果不明顯,腫瘤體積達(dá)到800mm3左右;P/LNPs-MF2作用后腫瘤組織切片觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)大面積變形和死亡,而P/LNPs-BM只殺滅了小部分的腫瘤細(xì)胞;體內(nèi)基因沉默研究結(jié)果進(jìn)一步顯示載siRNA的P/LNPs-MF2顯著的抑制VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平,誘導(dǎo)強(qiáng)烈的基因沉默作用。此外,裸鼠的生理體征、各器官組織切片及血清參數(shù)均表明P/LNPs在體內(nèi)安全可靠,是安全高效的siRNA遞送載體。綜上所述,通過微流控技術(shù)構(gòu)建的P/LNPs-MF納米載體,在載體理化性質(zhì)、siRNA遞送效率等方面,均優(yōu)于傳統(tǒng)乙醇注入技術(shù)制備的P/LNPs-BM�？梢�,微流控芯片作為一種新的納米制劑制備技術(shù),促進(jìn)了納米給藥系統(tǒng)的發(fā)展進(jìn)步,為納米制劑下一步的放大生產(chǎn)以及臨床研究提供了技術(shù)支持。
[Abstract]:Nanocarriers as an effective delivery system for gene drugs have attracted the attention of a large number of researchers since their appearance. However, the development of nanocarriers has been slow in the past 50 years, mainly due to the backwardness of the preparation technology of nanoparticles. Nowadays, microfluidic technology with good controllability, reproducibility and stability has been used in the production and preparation of nanocarriers, which can improve the preparation efficiency, shorten the preparation time, simplify the operation procedure and prepare uniform and narrow nanoparticles. Polymer-lipid hybrid nanoparticles (P/LNPs) were constructed by the combination of cationic lipids and polyethylenimide. Two microfluidic chips (MF1, MF2) were designed to prepare P/LNPs (P/LNPs-MF1, P/LNPs-MF2) for the delivery of VEGF siRNA. The stability, safety and performance of P/LNPs-MF were investigated. P/LNPs-BM prepared by ethanol injection method (BM) was used as the positive control. The main contents of this paper are summarized as follows: 1. The formulation and preparation process of P/LNPs-MF prepared by microfluidic chip technology were optimized to prepare uniformly dispersed P/LNPs-MF. The experimental results showed that DODMA, EggPC, Cholesterol, PEI and DSPE-mPEG2000 were mixed with siRNA at the confluence flow rate of 0.8mg/ml at the prescription ratio of 40/19/35/5/1. After ultrasonic treatment, P/LNPs-MF nanoparticles with proper size, uniform distribution and good stability were prepared. Among them, P/LNPs-MF2 had the best effect, with a particle size of 119.8nm, PDI of 0.096, and potential of 0.8mg/ml. At 11.3 mV, the serum remained stable after incubation for 12 hours, and there was no significant change after incubation at 4 C for 30 days. However, the P/LNPs-BM nanoparticles prepared by traditional methods had larger particle size and more dispersive distribution. MTT assay showed that the survival rates of all blank P/LNPs cells were above 80%. On the contrary, the siRNA-loaded P/LNPs-MF showed a significant inhibitory effect, which was only 20% higher than that of P/LNPs-BM. The results of flow cytometry and confocal laser microscopy showed that P/LNPs-MF2 had the highest uptake effect in A549, HepG-2 and MCF-7 cell lines, while P/LNPs-BM and P/LNPs-MF1 had the similar effect and were lower than P/LNPs-MF2 in the determination of VEGF mRNA by qRT-RCR. P/LNPs-MF2 of iRNA could inhibit the expression of 62.2% VEGF mRNA, and the inhibitory effect was 12.6% and 19.9% more than that of P/LNPs-MF1 and P/LNPs-BM, respectively. Western-blot assay of VEGF protein was consistent with qRT-RCR, which proved that the gene silencing efficiency of P/LNPs-MF2 was more significant than that of P/LNPs-MF1 and P/LNPs-BM. 3.P/LNPs-MF in vivo anti-tumor evaluation of microfluidics-MF. The siRNA-loaded P/LNPs-MF prepared by controlled-chip technique was investigated in vivo in order to evaluate the drug metabolism, tumor growth inhibition, gene silencing and safety toxicity of P/LNPs-MF. Pharmacokinetic parameters showed that P/LNPs-MF2 avoided the elimination of reticuloendothelial system and prolonged siRNA in vivo. The results of in vivo tumor inhibition showed that P/LNPs-MF2 could inhibit the tumor volume to about 300 mm3. After continuous administration of P/LNPs-MF2, the tumor growth was stagnated and negative growth was observed, and the tumor size was reduced to 0.23 g. However, the inhibition effect of P/LNPs-BM was not obvious, and the tumor volume reached 800 mm3 left. Right; P/LNPs-MF2 induced large area of deformation and death of tumor cells, while P/LNPs-BM killed only a small part of tumor cells. In vivo gene silencing further showed that siRNA-loaded P/LNPs-MF2 significantly inhibited the expression of VEGF mRNA and protein, and induced strong gene silencing. The physiological signs, tissue sections and serum parameters of nude mice showed that P/LNPs were safe and reliable in vivo and were safe and efficient siRNA delivery vectors. It can be seen that microfluidic chip, as a new preparation technology of nanoparticles, promotes the development and progress of nanodrug delivery system, and provides technical support for the next step of nanoparticles scale-up production and clinical research.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R943

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本文編號：2193077