【摘要】：羊毛甾醇合酶催化的2,3-氧化鯊烯環(huán)化是麥角甾醇和三萜類化合物生物合成分支形成的關(guān)鍵位點,下調(diào)2,3-氧化鯊烯流向麥角甾醇的代謝途徑可促進其流向三萜類化合物的代謝途徑。有鑒于此,本研究根據(jù)釀酒酵母羊毛甾醇合酶基因(lanosterol synthase gene,erg7)序列設計引物,擴增5'長片段(包括erg7基因5'非編碼區(qū)啟動子序列和部分編碼區(qū)序列)、5'短片段(包括erg7基因5'非編碼區(qū)部分啟動子序列和部分編碼區(qū)序列)和erg7基因編碼區(qū)片段,分別將其反向克隆到表達載體p ESC-URA上,構(gòu)建反義表達質(zhì)粒。用反義表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSc1,在營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基SD-URA上篩選重組菌株。通過半定量PCR進行檢測,結(jié)果表明:與INVSc1相比,轉(zhuǎn)入erg7基因編碼區(qū)反義片段的重組菌株內(nèi)羊毛甾醇合酶基因表達量沒有顯著變化,而轉(zhuǎn)入5'長反義片段和5'短反義片段的重組菌株內(nèi)羊毛甾醇合酶基因表達量明顯降低。通過TLC和HPLC方法比較麥角甾醇含量,結(jié)果表明:與INVSc1相比,轉(zhuǎn)入5'短反義片段和erg7基因編碼區(qū)反義片段的重組菌株內(nèi)麥角甾醇含量沒有顯著變化,而轉(zhuǎn)入5'長反義片段的重組菌株內(nèi)麥角甾醇含量明顯降低。本研究利用反義RNA技術(shù)抑制釀酒酵母中羊毛甾醇合酶基因的表達,為應用合成生物學技術(shù)在釀酒酵母中組建三萜類化合物代謝途徑奠定了基礎。
[Abstract]:The cyclization of squalene, catalyzed by wool sterol synthase, is the key site for the formation of branches of ergosterol and triterpenoid compounds. Down-regulating the metabolic pathway of squalene to ergosterol can promote its metabolic pathway to triterpenoid compounds. In this study, primers were designed based on the sequence of the wool sterol synthase gene (lanosterol synthase geneerg7) of Saccharomyces cerevisiae. Amplification of 5'long fragment (including 5'non-coding region promoter sequence and partial coding region sequence of erg7 gene) and erg7 gene coding region (including partial promoter sequence and partial coding region sequence of erg7 gene), The antisense expression plasmid was constructed by reverse cloning into the expression vector p ESC-URA. The recombinant strain of Saccharomyces cerevisiae INVSc1 was transformed by antisense expression plasmid, and the recombinant strain was screened on the nutrition-deficient medium SD-URA. The results of semi-quantitative PCR analysis showed that there was no significant change in the expression of wool sterol synthase gene in the recombinant strain transformed into antisense fragment of erg7 gene coding region compared with INVSc1. However, the expression of wool sterol synthase gene in 5 'long antisense and 5' short antisense fragments was significantly decreased. The ergosterol content was compared by TLC and HPLC. The results showed that the ergosterol content in the recombinant strain transformed into 5 'short antisense fragment and erg7 gene coding region antisense fragment had no significant change compared with INVSc1. The ergosterol content of the recombinant strain transformed into 5 'long antisense fragment was significantly decreased. In this study, antisense RNA technique was used to inhibit the expression of wool sterol synthase gene in Saccharomyces cerevisiae, which laid a foundation for the metabolic pathway of triterpenoids in Saccharomyces cerevisiae.
【作者單位】： 中國醫(yī)學科學院、北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所 天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室 衛(wèi)生部天然藥物生物合成重點實驗室;
【基金】：北京市自然科學基金資助項目(7122115) 天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室自主課題
【分類號】：R915

【參考文獻】

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【共引文獻】

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本文編號：2172475