【摘要】：目的：本研究旨在通過建立OATP1B1388GG和521CC基因多態(tài)表達(dá)平臺(tái),并運(yùn)用此平臺(tái)研究OATP1B1388GG;和521CC基因多態(tài)對(duì)他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)細(xì)胞攝取研究。 方法：運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù),構(gòu)建pcDNA3.1(-)OATP1B1質(zhì)粒,再運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù)的方法建立pcDNA3.1(-)-OATP1B1388GG和521CC質(zhì)粒。在轉(zhuǎn)染前,運(yùn)用Real-time PCR,檢測HEK293/MCF-7SLCO1B1的表達(dá)量。將建立完成的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293/MCF-7細(xì)胞,通過Western-blot,檢驗(yàn)OATP1B1蛋白表達(dá)；再通過PCR,驗(yàn)證各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況。本次實(shí)驗(yàn)分為6組,分別為：A組為HEK293/MCF-7;B組為HEK293/MCF-7給予TAM;C組為HEK293/MCF-7轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)質(zhì)粒給予TAM; D組為HEK293/MCF-7轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)OATP1B1質(zhì)粒給予TAM; E組為HEK293/MCF-7轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)OATP1B1388GG質(zhì)粒給予TAM; F組為HEK293/MCF-7轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)OATP1B1521CC質(zhì)粒給予TAM。本次實(shí)驗(yàn),運(yùn)用pcDN A3.1(-)OATP1B1-HEK293基因多態(tài)性細(xì)胞表達(dá)平臺(tái),分別加入10μM、30μM和100μM TAM分別作用24h后和48h后,運(yùn)用HPLC-MS/MS測定TAM在HEK293細(xì)胞內(nèi)濃度。同時(shí)本次實(shí)驗(yàn)分別加入10μM TAM作用pcDNA3.1(-)OATP1B1-MCF-7分別在24h后和48h后,應(yīng)用MTT和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞抑制率、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期變化。 結(jié)果：1)給藥24h后和48h后,各劑量組,B和C組細(xì)胞中TAM含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；B組細(xì)胞中TAM含量顯著低于D、E和F組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)(P0.05)；D組細(xì)胞中TAM含量略高于E和F組,各組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2)給藥24h后和48h后,B和C組抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；B組抑制率顯著低于D、E和F組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)(P0.05)；D組抑制率略高于E和F組,各組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3)給藥24h后和48h后,B和C組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；B組細(xì)胞凋亡率顯著低于D、E和F組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)(P0.05)；D組細(xì)胞凋亡率略高于E和F組,各組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 4)給藥24h后和48h后,與A組相比,B、C、D、E和F組細(xì)胞周期阻滯于Go／G1期,S和G2M期細(xì)胞減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)(P0.05)；但是B和C組細(xì)胞周期之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；B組細(xì)胞周期與D、E和F組,Go／G1期減少,S和G2M期細(xì)胞增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)(P0.05)；D組Go／G1期略多于E和F組,S和G2M期略減少E和F組,各組之間比較差異差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論：建立OATP1B1388GG和521CC基因多態(tài)表達(dá)平臺(tái),研究表明,OATP1B1388GG和521CC突變導(dǎo)致OATP1B1的攝取TAM能力降低,但與未突變基因組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[Abstract]:Aim: to study the uptake of OATP1B1388GG and 521CC gene polymorphisms in Tamoxifentam cells by establishing a polymorphic expression platform for OATP1B1388GG and 521CC, and using this platform to study the uptake of OATP-1B1388GG and 521CC gene polymorphisms in Tamoxifentam cells. Methods: pcDNA3.1 (-) OATP1B1 plasmids were constructed by molecular biology technique, and pcDNA3.1 (-) -OACA1B1388GG and 521CC plasmids were constructed by site-directed mutagenesis. Before transfection, Real-time PCR was used to detect the expression of HEK293/MCF-7SLCO1B1. The constructed plasmids were transfected into HEK293/MCF-7 cells, and the expression of OATP1B1 protein was detected by Western-blot. The experiment was divided into six groups: group A: HEK293 / MCF-7B: HEK293/MCF-7: TAMM-C: HEK293/MCF-7 transfected with pcDNA3.1 (-) plasmid; group D: HEK293/MCF-7 transfected with pcDNA3.1 (-) OATP1B1 plasmid; group E: HEK293/MCF-7 transfected pcDNA3.1 (-) OATP1B1388GG plasmid; group F: HEK293/MCF-7 transfected pcDNA3.1 (-) OATP1B1521CC plasmid. In this experiment, the expression platform of pcDN A3.1 (-) OATP1B1-HEK293 gene polymorphism cells was used, 10 渭 M 30 渭 M and 100 渭 M TAM were added for 24 h and 48 h, respectively. The concentration of TAM in HEK293 cells was measured by HPLC-MS/MS. At the same time, pcDNA3.1 (-) OATP1B1-MCF-7 was treated with 10 渭 M TAM for 24 h and 48 h, respectively. The inhibition rate, apoptosis and cell cycle were detected by MTT and flow cytometry. Results there was no significant difference in TAM content between groups B and C after 24 and 48 hours (P0.05) the content of TAM in group B was significantly lower than that in group D and group F (P0.05). The content of TAM in group D was slightly higher than that in group E and F (P0.05). There was no significant difference between the two groups (P0.05). There was no significant difference in inhibition rate between group B and group C after 24 hours and 48 hours (P0.05). The inhibitory rate of group B was significantly lower than that of group D and group F (P0.05). The inhibitory rate of group D was slightly higher than that of group E and F (P0.05). There was no significant difference between the two groups (P0.05). 3) there was no significant difference in apoptosis rate between group B and group C after 24 hours and 48 hours (P0.05). The apoptosis rate of group B was significantly lower than that of group D E and group F (P0.05). The rate of apoptosis in group D was slightly higher than that in group E and F, and there was no significant difference between the groups (P0.05). After 24 hours and 48 hours of administration, the cell cycle of group D and group F was blocked in the Go/G1 phase, and the cells in S and G 2m phases were decreased. The difference was statistically significant (P0.05), but there was no significant difference between group B and group C (P0.05). The cell cycle in group B and group D, E and F decreased the increase of cells in S and G 2m phase (P0.05). The Go/G1 phase in group D was slightly lower than that in group E and F in S and G 2m, and there was no significant difference between the two groups (P0.05). Conclusion: the polymorphic expression platform of OATP1B1388GG and 521CC genes was established. The results showed that the mutation of OATP 1B1388GG and 521CC resulted in a decrease in the ability of OATP1B1 to uptake TAM, but there was no significant difference compared with the unmutated genome.
【學(xué)位授予單位】：皖南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2166840