發(fā)布時間：2018-08-03 17:22

【摘要】：肝纖維化(liver fibrosis)是臨床常見的慢性進(jìn)行性疾病,由一種或多種病因長期反復(fù)作用形成彌漫性肝損害,包括病毒、酒精、肝毒性藥物及外源性毒物、自身免疫性疾病等,表現(xiàn)為肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生和肝內(nèi)細(xì)胞外間質(zhì)成分過度異常地沉積,影響肝臟的功能。細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450,CYP450)是一類含有亞鐵血紅素蛋白的超家族代謝酶,主要參與多種內(nèi)源性物質(zhì)(如脂肪酸、類花生四烯酸以及甾醇類)和外源性物質(zhì)(如亞硝胺類、醇類、藥物等)的I相生物轉(zhuǎn)化,其中CYP2E1是參與上述各物質(zhì)代謝最重要的酶類。二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine,DEN)是N-亞硝胺家族的典型致癌物,它廣泛存在于日常生活接觸的多種物質(zhì)中。DEN在CYP2E1催化下首先發(fā)生a-羥基化反應(yīng)生成a-羥基烷基亞硝胺,a-羥基烷基亞硝胺分解產(chǎn)物與DNA結(jié)合,形成DNA烷基加合物,最終導(dǎo)致肝臟損傷,因此DEN廣泛用于大鼠肝纖維化以及肝癌模型的建立。氯美噻唑(clomethiazole,CMZ)是硫胺素噻唑啉衍生化合物,有鎮(zhèn)靜、催眠、抗焦慮的作用,在歐洲一些國家廣泛用于酒精戒斷癥狀包括震顫性譫妄的治療。CMZ作為CYP2E1的抑制劑,對人體代謝氯唑沙宗具有顯著的抑制作用。由于CYP2E1在多種物質(zhì)的毒代動力學(xué)和藥代動力學(xué)中有重要作用,因此CMZ可以作為抑制劑用于闡述體內(nèi)CYP2E1在異生型物質(zhì)活化和代謝中的重要作用,進(jìn)一步可用于研究抑制CYP2E1代謝小分子毒物誘發(fā)的肝臟疾病。本研究所前期研究證明肝癌患者肝纖維化組織CYP2E1的活性顯著升高,可導(dǎo)致DEN產(chǎn)生更多的致癌物誘導(dǎo)肝臟損傷,那么有必要考察抑制CYP2E1對DEN的代謝對肝纖維化病理發(fā)展程度的影響。本研究擬以大鼠為研究對象,建立DEN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型,以CMZ為CYP2E1抑制劑,研究CMZ對正常及肝纖維化大鼠DEN毒代動力學(xué)的影響,并探討CMZ對DEN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化病理進(jìn)程的影響,以期為臨床肝纖維化的預(yù)防和治療提供新的思路和途徑。方法1氯美噻唑(CMZ)對二乙基亞硝胺(DEN)毒代動力學(xué)的影響1.1大鼠血漿中二乙基亞硝胺(DEN)濃度的測定血漿中DEN選用高氯酸進(jìn)行蛋白沉淀,DEN樣品的濃度測定選用HPLC-UV法。所建立的測定方法在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系(r20.999),日間、日內(nèi)變異均小于15%,回收率在85%~115%之間,不同放置條件下穩(wěn)定性良好,說明所建立的分析方法符合生物樣本的測定要求。1.2氯美噻唑(CMZ)對正常大鼠二乙基亞硝胺(DEN)毒代動力學(xué)的影響采用自身對照實(shí)驗(yàn),選取12只正常雄性SD大鼠分別考察單用DEN(50mg/kg,i.p)毒代動力學(xué)和高(100mg/kg,i.p)、中(50mg/kg,i.p)、低(10mg/kg,i.p)劑量CMZ聯(lián)合DEN(50mg/kg,i.p)對毒代動力學(xué)的影響,分別于用藥前、用藥后1、4、10、25min及1、2.5、4.5、7、10、24、48 h眼眶采血0.3ml,分離血漿保存于-30℃待測。1.3氯美噻唑(CMZ)對肝纖維化大鼠二乙基亞硝胺(DEN)毒代動力學(xué)的影響采用自身對照實(shí)驗(yàn),選取10只DEN誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠,于肝纖維化模型12周時分別考察單獨(dú)DEN(50mg/kg,i.p)毒代動力學(xué)和CMZ(50mg/kg,i.p)聯(lián)合DEN(50mg/kg,i.p)對肝纖維化大鼠DEN毒代動力學(xué)的影響。2氯美噻唑(CMZ)對二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型的影響2.1大鼠肝纖維化模型的建立雄性SD大鼠44只隨機(jī)分成5組,空白對照組(n=10)、DEN誘導(dǎo)模型組(50mg/kg,i.p.n=10)、CMZ高(100mg/kg,i.p.n=8)、中(50mg/kg,i.p.n=8)、低(10mg/kg,i.p.n=8)劑量干預(yù)組。DEN模型組前4周每周兩次DEN給藥,第5周至第12周每周一次DEN給藥。CMZ干預(yù)組,除首次單用DEN給藥外,前4周每周兩次CMZ聯(lián)合DEN給藥,第5周至第12周每周一次CMZ聯(lián)合DEN給藥。2.2氯美噻唑(CMZ)在大鼠肝纖維化模型建立過程中對二乙基亞硝胺(DEN)毒代動力學(xué)的影響CMZ干預(yù)組給藥期間分別于第一周首次DEN給藥和首次CMZ聯(lián)合DEN給藥時考察不同劑量CMZ對大鼠DEN毒代動力學(xué)的影響,在12周肝纖維化時期考察不同劑量CMZ聯(lián)合DEN給藥對大鼠DEN毒代動力學(xué)的影響,采血量及時間同上。各實(shí)驗(yàn)組大鼠于12周處死,留取肝臟標(biāo)本用于病理檢測分析。2.3氯美噻唑(CMZ)對二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的影響分別計(jì)算以上各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟指數(shù)(肝重/體重);采用HE和Masson染色的方法對肝標(biāo)本病理檢測分析,并依據(jù)Ishak評分系統(tǒng)對各組病理結(jié)果進(jìn)行評分;采用免疫組化的方法分別檢測肝標(biāo)本增值細(xì)胞核抗原(PCNA)、細(xì)胞增殖指數(shù)(Ki-67)的陽性表達(dá)率以及胎盤型谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST-P)的光密度值。2.4氯美噻唑(CMZ)對CYP2E1的抑制作用與大鼠肝纖維化的相關(guān)性分別統(tǒng)計(jì)各劑量組大鼠CMZ抑制后毒代動力學(xué)參數(shù)(AUC0-t,AUC0-∞,CL)與上述大鼠肝纖維化指標(biāo)(Ishak評分、Masson)的相關(guān)性。3統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對各項(xiàng)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。毒代動力學(xué)參數(shù)的計(jì)算采用Das 2.1進(jìn)行計(jì)算。各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),對非正態(tài)分布的數(shù)據(jù),采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)a為0.05。結(jié)果1氯美噻唑(CMZ)對二乙基亞硝胺(DEN)毒代動力學(xué)的影響1.1氯美噻唑(CMZ)對正常大鼠二乙基亞硝胺(DEN)毒代動力學(xué)的影響與對照組(單次DEN)比較,CMZ低、中、高劑量分別使DEN清除率CL下降(44.49±10.16)%、(58.35±9.14)%、(69.35±5.03)%,半衰期t1/2分別延長(89.82±121.70)%、(317.64±128.80)%、(438.32±127.51)%,曲線下面積AUC0-t分別擴(kuò)大(80.12±32.85)%、(117.83±45.71)%、(192.37±47.77)%,曲線下面積AUC0-∞分別擴(kuò)大(88.97±44.88)%、(127.58±43.27)%、(218.21±51.27)%,分布容積Vd中、高劑量擴(kuò)大(70.60±50.71)、(64.87±42.44)%(P0.05)。而峰濃度Cmax和達(dá)峰時間Tmax無明顯改變(P0.05),提示不同劑量CMZ明顯改變了DEN在大鼠體內(nèi)的毒代動力學(xué)。結(jié)果顯示,CMZ對大鼠體內(nèi)CYP2E1代謝DEN有顯著的抑制作用,呈現(xiàn)較好的劑量依賴關(guān)系。1.2氯美噻唑(CMZ)對肝纖維化大鼠二乙基亞硝胺(DEN)毒代動力學(xué)的影響肝纖維化大鼠CMZ抑制后毒代動力學(xué)參數(shù)與抑制前相比,Cmax擴(kuò)大(38.17±16.50)%、AUC0-t擴(kuò)大(168.46±35.96)%、AUC0-∞擴(kuò)大(385.60±174.39)%、t1/2延長(189.00±173.95)%、CL下降(64.32±10.02)%(P0.05),結(jié)果提示CMZ對肝纖維化大鼠代謝DEN有明顯的抑制作用。2氯美噻唑(CMZ)對二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型的影響2.1氯美噻唑(CMZ)對二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)肝纖維化模型的影響CMZ干預(yù)組和模型組大鼠的體重較對照組均顯著性下降(P0.05),但CMZ干預(yù)組和模型組四組間大鼠體重的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CMZ干預(yù)組較模型組大鼠肝臟明顯呈現(xiàn)數(shù)量較少、體積較小的硬化結(jié)節(jié)。CMZ干預(yù)組和模型組大鼠的肝臟指數(shù)、Ishak評分、Masson染色陽性面積百分比、PCNA陽性面積百分比、Ki-67陽性面積百分比、GST-P光密度值均高于對照組(P0.05)。CMZ干預(yù)組肝標(biāo)本Masson染色陽性面積百分比、PCNA陽性面積百分比、Ki-67陽性面積百分比均低于模型組(P0.05),但CMZ干預(yù)組GST-P光密度值與模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。高劑量組CMZ肝標(biāo)本Ishak評分低于模型組(P0.05)。高劑量組CMZ肝標(biāo)本Ishak評分、肝臟指數(shù)和Masson染色陽性面積百分比較低劑量組均顯著下降(P0.05)。高劑量組CMZ肝標(biāo)本Ishak評分和Masson染色陽性面積百分比均低于中劑量組(P0.05)。中劑量組CMZ肝標(biāo)本PCNA陽性面積百分比較低劑量組有所升高(P0.05)。肝臟指數(shù)和Ishak評分在模型組與CMZ中、低劑量組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,Ki-67陽性面積百分比在CMZ高、中、低劑量組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,GST-P光密度值在以上四組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)果表明,CMZ的預(yù)防用藥顯著減少了大鼠肝臟纖維化的病變程度。2.2氯美噻唑(CMZ)在大鼠肝纖維化模型建立過程中對二乙基亞硝胺(DEN)毒代動力學(xué)的影響CMZ各劑量干預(yù)組在大鼠正常時期,低劑量CMZ抑制后DEN的AUC0-t擴(kuò)大(139.90±40.77)%、AUC0-∞擴(kuò)大(142.81±42.13)%、t1/2延長(260.95±121.88)%、CL下降(57.79±6.83)%(P0.05);中劑量CMZ抑制后DEN的AUC0-t擴(kuò)大(269.63±50.40)%、AUC0-∞擴(kuò)大(270.21±50.38)%、t1/2延長(349.22±121.25)%、CL下降(72.57±3.72)%(P0.05);高劑量CMZ抑制后DEN的AUC0-t擴(kuò)大(428.89±56.72)%、AUC0-∞擴(kuò)大(453.43±68.26)%、t1/2延長(522.32±443.48)%、CL下降(81.69±2.25)%(P0.05);CMZ各劑量干預(yù)組在大鼠肝纖維化時期,低劑量CMZ抑制后毒代動力學(xué)參數(shù)較正常時期CMZ抑制后毒代動力學(xué)參數(shù)相比,AUC0-t擴(kuò)大(45.63±38.58)%、AUC0-∞擴(kuò)大(60.50±54.83)%、t1/2延長(63.29±82.17)%、CL下降(29.83±28.38)%(P0.05);中劑量CMZ抑制后毒代動力學(xué)參數(shù)較正常時期CMZ抑制后毒代動力學(xué)參數(shù)相比,AUC0-t擴(kuò)大(61.60±24.46)%、AUC0-∞擴(kuò)大(100.18±60.74)%、t1/2延長(136.85±130.47)%、CL下降(45.90±16.06)%(P0.05);高劑量CMZ抑制后毒代動力學(xué)參數(shù)較正常時期CMZ抑制后毒代動力學(xué)參數(shù)相比AUC0-t擴(kuò)大(61.62±19.73)%、AUC0-∞擴(kuò)大(62.77±76.86)%、t1/2延長(218.50±250.04)%、CL下降(25.54±34.50)%(P0.05)。結(jié)果顯示高、中、低劑量CMZ均顯著抑制了大鼠在正常及肝纖維化時期體內(nèi)CYP2E1對DEN的代謝。2.3氯美噻唑(CMZ)對CYP2E1的抑制作用與大鼠肝纖維化的相關(guān)性CMZ抑制后大鼠毒代動力學(xué)參數(shù)AUC0-t與Ishak纖維化評分(R=-0.511、P=0.011)以及Masson染色陽性面積百分比(R=-0.514、P=0.010)呈顯著的負(fù)相關(guān);毒代動力學(xué)參數(shù)AUC0-∞與Ishak纖維化評分(R=-0.511、P=0.011)以及Masson染色陽性面積百分比(R=-0.447、P=0.028)呈顯著的負(fù)相關(guān);清除率CL與Ishak纖維化評分(R=0.428、P=0.037)以及Masson染色陽性面積百分比(R=0.407、P=0.049)呈顯著的正相關(guān)。結(jié)果顯示,各CMZ干預(yù)組大鼠CMZ抑制后DEN體內(nèi)暴露量與肝纖維化程度呈負(fù)相關(guān),清除率呈正相關(guān)。隨著CMZ劑量的增加,CMZ對大鼠體內(nèi)DEN的代謝抑制作用越明顯,DEN所誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化程度就越輕。進(jìn)一步表明,DEN通過CYP2E1的代謝而誘導(dǎo)了大鼠的肝纖維化,CMZ通過抑制CYP2E1的活性明顯減輕了DEN誘導(dǎo)的肝纖維化程度。結(jié)論1.CMZ的干預(yù)顯著降低了大鼠的肝纖維化程度,并呈現(xiàn)劑量依賴性。2.CMZ顯著抑制了正常及肝纖維化大鼠體內(nèi)CYP2E1對DEN的代謝。3.CMZ對大鼠肝纖維化的預(yù)防作用與CMZ對CYP2E1的抑制作用有顯著的相關(guān)性,CMZ通過抑制CYP2E1有效減輕了DEN誘導(dǎo)的肝纖維化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R965

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本文編號：2162445