【摘要】：【研究背景】 據(jù)統(tǒng)計(jì)2010年全球約有2.73億人患有焦慮癥（anxiety disorder），約占總?cè)丝诘?.5%，其中女性多于男性，分別為5.2%和2.8%。在歐洲、非洲和亞洲，終生患病率在9-16%，年患病率在4-7%之間，而在美國(guó)發(fā)病率明顯提高，終生患病率約為29%，11-18%的成年人在一生當(dāng)中曾經(jīng)遭遇這種狀態(tài)。 目前認(rèn)為，焦慮癥的發(fā)生主要由以下幾個(gè)因素引起：藥物、心理因素、壓力、持續(xù)性的焦慮狀態(tài)、遺傳和家庭因素、文化背景以及神經(jīng)回路信息傳遞異常。這些因素中的一個(gè)或多個(gè)相互作用從而導(dǎo)致不同類型焦慮癥的發(fā)生。 經(jīng)過多年的努力，人們對(duì)焦慮癥的發(fā)病機(jī)制雖然有了更深入的認(rèn)識(shí)，但其分子生物學(xué)基礎(chǔ)仍不清楚。除了多種神經(jīng)遞質(zhì)參與其中以外，研究人員也發(fā)現(xiàn)了與焦慮行為相關(guān)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，或許這一神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的信息傳遞異常才是焦慮癥發(fā)生的根本原因。鑒于此，有學(xué)者提出了焦慮癥的細(xì)胞模型，認(rèn)為病理性焦慮癥是由于杏仁核起關(guān)鍵作用的神經(jīng)環(huán)路E/I平衡(balance of excitation and inhibition)紊亂所導(dǎo)致的。因此，針對(duì)參與引起焦慮調(diào)節(jié)的分子，如神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)系統(tǒng)或者細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白等，通過改善E/I平衡，從而產(chǎn)生抗焦慮作用。 臨床上對(duì)焦慮癥的治療主要包括改變生活方式，心理治療和行為治療，而只有其他治療無效時(shí)才建議使用藥物治療。認(rèn)知行為療法（cognitive behavioral therapy,CBT）是目前最有效的焦慮癥心理治療手段，它有兩個(gè)主要組成成分：認(rèn)知和行為。目前臨床上焦慮癥的治療藥物主要有以下幾種，選擇性5-HT再攝取抑制劑（selectiveserotonin reuptake inhibitors, SSRIs），五羥色胺-去甲腎上腺素再攝取抑制劑（serotonin norepinephrine reuptake inhibitors, SNRIs），苯二氮類（benzodiazepines，BDZs），單胺氧化酶抑制劑和-鈣通道抗驚厥藥等。由于這些藥物明顯的副作用，如起效慢、順從性差、依賴性、以及可能的停藥反應(yīng)，研究人員正努力尋找新的治療方法和分子靶點(diǎn)，其中最重要的一個(gè)方向就是神經(jīng)肽類（neuropeptides）。涉及焦慮調(diào)節(jié)功能的神經(jīng)肽類數(shù)目正不斷增加，到目前為止，研究最廣泛的有促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin-releasing factor, CRF）、P物質(zhì)（substance P, SP）、血管升壓素（vasopressin, VP）、神經(jīng)肽Y（neuropeptide Y, NPY），其他類型如甘丙肽（galanin）、催產(chǎn)素（oxytocin）、胃動(dòng)素（motilin），近年來也得到更多關(guān)注。 Motilin是一種主要由十二指腸粘膜內(nèi)分泌細(xì)胞釋放促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)的腦腸肽，在胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system, CNS）中均有分布，motilin受體（MTLR）是一個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體，紅霉素（erythromycin, EM）是其最先發(fā)現(xiàn)的非肽類激動(dòng)劑。研究發(fā)現(xiàn)，除胃腸道外，MTLR也表達(dá)于杏仁核、海馬和下丘腦等與焦慮和恐懼記憶相關(guān)的神經(jīng)核團(tuán)。目前認(rèn)為，，杏仁核是神經(jīng)系統(tǒng)情緒控制，尤其是焦慮和恐懼相關(guān)刺激調(diào)節(jié)的核心區(qū)域。更為重要的是，有報(bào)道顯示腦室內(nèi)注射胃動(dòng)素具有明顯的抗焦慮作用，但其機(jī)制仍不清楚。同時(shí)，杏仁核底內(nèi)側(cè)注射motilin劑量依賴地增加了清醒大鼠的胃收縮，而且，motilin受體大量表達(dá)在基底外側(cè)杏仁核區(qū)（basolateral amygdala, BLA），所有這些提示motilin及其受體在杏仁核的表達(dá)不僅控制胃腸運(yùn)動(dòng)功能，可能在焦慮行為的調(diào)節(jié)中也具有重要作用。 【研究目的】 觀察杏仁核BLA區(qū)motilin受體激活對(duì)不同因素引起的小鼠焦慮樣行為的影響，考察杏仁核區(qū)motilin及其受體在不同神經(jīng)元上的表達(dá)差異，研究motilin對(duì)不同類型神經(jīng)元興奮性及神經(jīng)傳遞的作用，利用分子生物學(xué)、電生理學(xué)等手段揭示其可能的分子機(jī)制，為抗焦慮藥的研發(fā)提供新靶點(diǎn)，為焦慮癥的治療提供新的思路和理論依據(jù)。 【研究方法】 1.小鼠應(yīng)激模型建立 共建立了3種小鼠焦慮模型。1）小鼠置于自制水瓶中強(qiáng)迫游泳1或2次，每次30min，每天僅限一次，于不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)小鼠焦慮樣行為，選擇最佳參數(shù)為強(qiáng)迫游泳應(yīng)激引起的小鼠焦慮模型；2）小鼠置于束縛器中1或2次，每次2h，每天僅限一次，于不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)小鼠焦慮樣行為，選擇最佳參數(shù)。 2.小鼠慢性炎性痛模型建立 10μl完全弗氏佐劑（CFA）小鼠足底注射，于不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)小鼠焦慮樣行為，選擇最佳參數(shù)。 3.小鼠焦慮相關(guān)行為學(xué)檢測(cè) 1）高架十字迷宮（elevated plus maze, EPM）檢測(cè)：小鼠頭朝開臂放于裝置中間平臺(tái)區(qū)后，實(shí)驗(yàn)人員立即拉緊布簾，離開測(cè)試區(qū)，開始為期5min的檢測(cè)，軟件記錄開、閉臂滯留時(shí)間和進(jìn)臂次數(shù)。 2）曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：高架十字迷宮結(jié)束后立即進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)時(shí)，小鼠被放于盒子中央?yún)^(qū)，自由活動(dòng)15min，檢測(cè)小鼠在實(shí)驗(yàn)箱總活動(dòng)路程和中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間。我們定義實(shí)驗(yàn)箱正中間的15×15cm2區(qū)域?yàn)橹醒雲(yún)^(qū)，占整個(gè)面積的四分之一。每個(gè)箱子每次只允許檢測(cè)一只小鼠。 4. ELISA檢測(cè)強(qiáng)迫游泳應(yīng)激致焦慮小鼠和慢性炎性痛致焦慮小鼠杏仁核區(qū)motilin濃度的變化。 5. Western blot檢測(cè)焦慮小鼠MTLR表達(dá)的變化，以及藥物處理對(duì)其表達(dá)的影響。 6.杏仁核BLA區(qū)立體定位和微量注射 1）腦立體定位手術(shù)：套管定位于BLA區(qū)（bregma點(diǎn)后1.45mm，旁開3.5mm，下4.5mm）上部0.5mm后，立即用牙科水泥固定，待凝固后套管中插入套管帽。小鼠恢復(fù)一周后，開始行為學(xué)檢測(cè)。 2）局部微量注射：小鼠單獨(dú)放入小動(dòng)物麻醉機(jī)麻醉后，插入注射內(nèi)管（比套管長(zhǎng)0.5mm），用微量注射泵以0.5μl/min的速度通過套管注射不同藥物于雙側(cè)BLA區(qū)，每側(cè)注射1min，后留針1min。注射完畢后，小鼠放回籠中，30min后接受強(qiáng)迫游泳應(yīng)激處理。在慢性炎性痛實(shí)驗(yàn)中，注射完30min后，開始行為學(xué)檢測(cè)。 7.免疫熒光雙標(biāo)法考察MTLR在杏仁核的表達(dá)，檢測(cè)是否有細(xì)胞特異性分布。 8.電生理學(xué)檢測(cè)MTLR激活對(duì)興奮性和抑制性神經(jīng)元興奮性以及對(duì)興奮性和抑制性神經(jīng)傳遞的影響。 【研究結(jié)果】 1.束縛應(yīng)激1次，24h后小鼠產(chǎn)生焦慮樣行為，且兩次應(yīng)激24h后更為明顯；強(qiáng)迫游泳應(yīng)激1次12h后小鼠產(chǎn)生焦慮樣行為，24h后有所緩解，兩次應(yīng)激24h后則更為明顯；CFA注射14d后小鼠產(chǎn)生焦慮樣行為，且至少持續(xù)到28d后。 2.對(duì)MTLR表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，其表達(dá)水平隨束縛應(yīng)激次數(shù)的增加顯著下降，強(qiáng)迫游泳應(yīng)激兩次24h后及CFA注射14d后，其表達(dá)也明顯減少。ELISA檢測(cè)顯示，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)杏仁核motilin濃度也顯著降低。由于束縛應(yīng)激所用束縛器影響腦立體定位所留套管的穩(wěn)定性，容易造成套管脫落，所以下面實(shí)驗(yàn)采用了強(qiáng)迫游泳應(yīng)激模型和慢性炎性痛模型。 3.杏仁核BLA區(qū)局部注射后行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，motilin和EM注射顯著降低了強(qiáng)迫游泳應(yīng)激和慢性炎性痛小鼠EPM中開臂滯留時(shí)間和曠場(chǎng)試驗(yàn)中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間，而對(duì)閉臂進(jìn)入次數(shù)和活動(dòng)總距離沒有影響，且MTLR選擇性拮抗劑MA-2029能夠逆轉(zhuǎn)EM的這一作用。 4.免疫熒光結(jié)果顯示，在杏仁核區(qū)MTLR與抑制性神經(jīng)元特異性標(biāo)記物谷氨酸脫羧酶67（glutamic acid decarboxylase67, GAD67）共定位，且MTLR免疫陽性神經(jīng)元在BLA區(qū)明顯多于側(cè)核（lateral amygdala, LA）。 5.對(duì)神經(jīng)元興奮性檢測(cè)結(jié)果顯示，MTLR激活對(duì)BLA區(qū)錐體神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢话l(fā)放頻率以及靜息膜電位（rest membrane potential, RMP）沒有影響，但增加了中間神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢话l(fā)放頻率，且降低了其RMP，而MA-2029以及G蛋白抑制劑GDP-β-S阻斷了MTLR激活對(duì)神經(jīng)元興奮性的影響。 6.對(duì)抑制性神經(jīng)傳遞的影響檢測(cè)結(jié)果顯示，強(qiáng)迫游泳應(yīng)激和慢性炎性痛均減弱了BLA區(qū)錐體神經(jīng)元GABA能自發(fā)的抑制性突觸后電流（spontaneous inhibitorypostsynaptic currents, sIPSCs）的幅度和頻率， EM和motilin增加了正常和焦慮小鼠sIPSCs的幅度和頻率，且這一作用被MA-2029所抑制。然而，MTLR激活對(duì)GABA能小的抑制性突出后電流沒有影響（miniature inhibitory postsynapticcurrents, mIPSCs）。雙脈沖易化結(jié)果顯示，motilin顯著減弱了雙脈沖比率值（paired-pulse ratio, PPR），這一作用也能被MA-2029所阻斷。 7.對(duì)興奮性神經(jīng)傳遞的影響檢測(cè)結(jié)果顯示，MTLR激活對(duì)自發(fā)的興奮性突觸后電流（spontaneous excitatory postsynaptic currents, sEPSCs）和小的興奮性突出后電流（miniature excitatory postsynaptic currents, mEPSCs）的幅度和頻率都沒有影響。 8.對(duì)小鼠痛覺影響的檢測(cè)結(jié)果顯示，CFA注射14d后，與鹽水注射組相比，小鼠熱刺痛和機(jī)械痛痛閾明顯降低，但EM或motilin局部注射對(duì)熱刺痛和機(jī)械痛痛閾均沒有影響。 【研究結(jié)論】 本研究證實(shí)，MTLR選擇性表達(dá)在杏仁核區(qū)抑制性中間神經(jīng)元上；在束縛應(yīng)激、強(qiáng)迫游泳應(yīng)激以及慢性炎性痛導(dǎo)致的焦慮小鼠杏仁核區(qū)MTLR表達(dá)顯著下降，motilin濃度也明顯減少；而MTLR激動(dòng)劑motilin和EM于杏仁核BLA區(qū)注射產(chǎn)生明顯的抗焦慮作用；機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，MTLR激活選擇性增加BLA區(qū)中間神經(jīng)元興奮性，增強(qiáng)GABA能神經(jīng)傳遞，且這一作用是動(dòng)作電位依賴的，但對(duì)錐體神經(jīng)元興奮性以及興奮性神經(jīng)傳遞沒有影響。 我們的研究為抗焦慮藥的研發(fā)提供了一個(gè)新靶點(diǎn)，且首次揭示了motilin抗焦慮作用的電生理學(xué)基礎(chǔ)，為基于motilin受體激動(dòng)劑的抗焦慮藥研究提供了理論依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R964

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號(hào)：2151954