【摘要】：proSP-B(Precursor Surfactant Protein B)是肺表面活性蛋白B的前肽,其作為一個前體蛋白,在形成和調(diào)節(jié)肺表面活性蛋白B的形成過程中發(fā)揮著極其重要的作用。由于pro SP-B蛋白氨基酸序列的疏水性和其結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性,研究學(xué)者將其歸為鞘脂激活蛋白樣蛋白(Saposin-Like Proteins,SAPLIPs)超家族的一員,SAPLIPs家族成員作為一類具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的蛋白族群,具有非常廣譜的生物學(xué)功能,而抗菌活性是其最為重要的功能之一。而近幾年來,隨著抗生素在食品及醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的濫用及不合理使用,引起了耐藥、泛耐藥、交叉耐藥,甚至是超級細(xì)菌的不斷出現(xiàn),使得抗感染問題變的越來越嚴(yán)峻,而抗生素的毒副作用也使得人類的健康及生命安全面臨極大威脅。因此,開發(fā)一類新的高效,低毒,具有新的抗菌作用機(jī)制的藥物迫在眉睫�？咕淖鳛橐活愑缮矬w自身生理活動產(chǎn)生的,具有廣譜抗菌活性的小分子物質(zhì),日漸成為替代傳統(tǒng)抗生素的一類新型抗菌藥物。在本實(shí)驗(yàn)研究中,我們利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了pGEX4T-1-pro SP-B原核表達(dá)載體,并用IPTG成功誘導(dǎo)表達(dá)并純化出pro SP-B蛋白,分析pro SP-B蛋白在CCL149細(xì)胞中的定位和毒性作用,為pro SP-B蛋白的抗菌作用及作用機(jī)理奠定基礎(chǔ);接著濾紙片法檢測pro S-B蛋白對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的抗菌活性,再以金黃色葡萄球菌為試驗(yàn)菌,考察蛋白的抗菌作用機(jī)理,為開發(fā)新型的抗菌藥物奠定基礎(chǔ)。研究目的:本課題旨在研究通過基因工程技術(shù)構(gòu)建、表達(dá)、純化獲得pro SP-B重組蛋白,分析其毒性和抗菌活性及抗菌機(jī)制,為將pro SP-B開發(fā)成一種新型的抗菌藥物奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究方法:(1)構(gòu)建pGEX4T-1-pro SP-B原核表達(dá)載體,分析pro SP-B融合表達(dá)特性。proSP-B的氨基酸序列疏水性較強(qiáng),較難通過化學(xué)合成的方式獲得,實(shí)驗(yàn)中通過基因工程的方法將目的基因pro SP-B構(gòu)建到pGEX4T-1質(zhì)粒上,然后利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE、Western Blot檢測pro SP-B的表達(dá),并純化獲得pro SP-B蛋白。(2)考察pro SP-B蛋白的細(xì)胞熒光定位及細(xì)胞毒性。構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-N2-pro SP-B,然后將真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到CCL149細(xì)胞中,利用載體上攜帶的GFP基因,結(jié)合DAPI核染與DiI細(xì)胞膜染色,分析pro SP-B在細(xì)胞中的定位。將CCL149細(xì)胞與pro SP-B蛋白共孵育考察proSP-B蛋白的細(xì)胞毒性。(3)proSP-B蛋白的抗菌活性研究。培養(yǎng)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌,然后用濾紙片擴(kuò)散法考察pro SP-B蛋白的抗菌活性及抗菌譜。(4)proSP-B蛋白抗菌機(jī)理研究。選用金黃色葡萄球菌作為考察試驗(yàn)菌,利用碘化丙啶(PI)染色法和乳酸脫氫酶(LDH)酶活測定的方法研究分析pro SP-B蛋白的抗菌機(jī)理。研究結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了pro SP-B原核表達(dá)載體,并采用在延長表達(dá)時間的方法,成功促進(jìn)重組pro SP-B蛋白的可溶性表達(dá),并純化了pro SP-B蛋白,應(yīng)用BCA法測定其蛋白濃度為1 mg/mL。(2)利用分子生物學(xué)技術(shù)成功構(gòu)建了融合表達(dá)載體pEGFP-N2-pro SPB,發(fā)現(xiàn)GFP-pro SP-B表達(dá)的綠色熒光蛋白主要定位在CCL149細(xì)胞的細(xì)胞膜上,而單獨(dú)表達(dá)GFP的綠色熒光則分布在CCL149細(xì)胞的細(xì)胞胞質(zhì)中,說明pro SP-B能在CCL149細(xì)胞中特異性表達(dá),并定位在細(xì)胞膜上而發(fā)揮其膜結(jié)合性功能。(3)利用蛋白與細(xì)胞共培養(yǎng)的方式確定了proSP-B蛋白的細(xì)胞毒性,其IC50約為1595?g/mL,根據(jù)細(xì)胞毒性分級評價標(biāo)準(zhǔn)初步確定pro SP-B蛋白的細(xì)胞毒性是低毒的。(4)通過濾紙片法成功測定了金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌對pro SP-B蛋白的敏感性,并分別計(jì)算出其MIC值。發(fā)現(xiàn)pro SP-B蛋白對細(xì)菌、真菌均具有一定的抑制作用,且對革蘭陽性菌的作用大于革蘭氏陰性菌,對細(xì)菌的作用大于真菌。(5)以金黃色葡萄球菌作為實(shí)驗(yàn)對象,應(yīng)用PI熒光染色及LDH酶活法初步測定分析pro SP-B蛋白的抗菌機(jī)理,結(jié)合pro SP-B的細(xì)胞熒光定位,我們初步得出proSP-B發(fā)揮其抗菌活性的作用機(jī)理是pro SP-B蛋白作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜,通過改變細(xì)菌的膜結(jié)構(gòu)而影響細(xì)菌細(xì)胞膜的保護(hù)和調(diào)節(jié)作用,從而抑制或殺死細(xì)菌的。
[Abstract]:ProSP - B ( proSP - B ) is a propeptide of lung surface active protein B . As a precursor protein , it plays an important role in the formation and regulation of lung surface active protein B . The anti - bacterial activity of pro SP - B protein was investigated . The expression of pro SP - B protein was investigated . The expression of pro SP - B protein was investigated by means of gene engineering . ( 3 ) The effect of pro SP - B protein on the cell membrane of bacteria and fungi was determined by using PI fluorescence staining and LDH enzyme activity method .
【學(xué)位授予單位】：重慶理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R915

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2137591