本文選題：鐘基因 + Per1��； 參考：《蘇州大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：目的:觀察鐘基因Period1(Per1)和Period2(Per2)在LPS作用下對神經(jīng)炎癥的調(diào)控作用,并進一步研究其作用機制。方法:采用小鼠小膠質(zhì)瘤細胞系BV2細胞,分別對鐘基因Per1和Per2進行基因敲減后,使用脂多糖(LPS)100 ng/ml預(yù)處理12 h,用ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)基中的炎癥相關(guān)因子TNF-α和IL-6的釋放量,使用NO試劑盒檢測了NO的含量;用免疫印跡方法檢測細胞中炎癥相關(guān)蛋白iNOS和COX2的表達。使用Per1和Per2基因敲除鼠,分別在側(cè)腦室注射2μg LPS,建立在體神經(jīng)炎癥模型,6 h后取鼠腦,提取RNA。使用實時熒光定量PCR(q-PCR)的方法檢測炎癥的相關(guān)因子IL-6,TNF-α、i NOS和COX2的m RNA水平。側(cè)腦室注射2μg LPS 7天后取鼠腦,進行抗GFAP的免疫熒光法染色,檢測Per1和Per 2基因敲除對鼠腦星形膠質(zhì)細胞激活的影響。為了進一步證實Per1和Per2對神經(jīng)炎癥的作用,取新生Per1和Per2基因敲除鼠原代星形膠質(zhì)細胞進行培養(yǎng),培養(yǎng)成功后予以LPS 100 ng/ml刺激24 h,取細胞培養(yǎng)基用ELISA方法檢測炎癥相關(guān)因子TNF-α和IL-6的釋放;同時用免疫印跡方法檢測細胞中炎癥相關(guān)蛋白iNOS和COX2的表達。為了探討鐘基因Per1和Per2對神經(jīng)炎癥產(chǎn)生影響的作用機制,使用了Per1、Per2基因敲除鼠的原代星形膠質(zhì)細胞給予LPS100 ng/ml刺激后用免疫印跡方法檢測NF-κB通路中p65和IκBα的表達,并且使用免疫熒光技術(shù)檢測了p65核轉(zhuǎn)位情況;使用核質(zhì)分離技術(shù)檢測Per2基因敲減的BV2細胞在LPS刺激后細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)p65的蛋白含量。結(jié)果:與對照組相比,Per1基因敲減的BV2細胞在LPS刺激12 h后,細胞培養(yǎng)基中釋放TNF-α和IL-6的量明顯減少,NO的含量明顯降低;細胞中激活i NOS和COX2的表達也顯著減少。Per2基因敲減的BV2細胞在LPS刺激下細胞培養(yǎng)基中釋放的TNF-α和IL-6顯著升高,NO的含量明顯上升。細胞中激活的i NOS和COX2的表達明顯增加。與野生型鼠相比較,LPS作用下Per1基因敲除鼠腦中IL-6、TNF-α、i NOS和COX2的m RNA水平顯著降低;Per2基因敲除鼠腦中IL-6、TNF-α、i NOS和COX2的m RNA水平顯著升高�？笹FAP免疫熒光結(jié)果顯示,Per1基因敲除能夠抑制LPS誘導(dǎo)鼠腦星形膠質(zhì)細胞的激活,在局部皮層和紋狀體區(qū)域抑制作用較明顯;而Per2基因敲除能夠顯著增加LPS誘導(dǎo)鼠腦星形膠質(zhì)細胞激活的反應(yīng),在局部皮層與紋狀體區(qū)域增強星形膠質(zhì)細胞激活反應(yīng)尤其明顯。在原代星形膠質(zhì)細胞模型中,與野生型鼠的原代星形膠質(zhì)細胞相比較,在給予了LPS刺激后Per1基因敲除鼠的原代星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)基中TNF-α和IL-6的含量顯著降低,同時細胞中i NOS和COX2的表達也下降。而在Per2基因敲除鼠的原代星形膠質(zhì)細胞中,釋放到細胞培養(yǎng)基中的TNF-α,IL-6的含量顯著提高,同時細胞中i NOS和COX2的表達也明顯增加。在對機制的研究中發(fā)現(xiàn),與野生型鼠相比較,Per1基因敲除鼠原代星形膠質(zhì)細胞在LPS的誘導(dǎo)下,隨著時間的延長,p65的表達量減少。Per2基因敲除鼠原代星形膠質(zhì)細胞中加入LPS后p65的表達不變,但是IκBα的蛋白量在給予LPS后顯著減少;同時在LPS刺激30 min后,免疫細胞學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)原代星形膠質(zhì)細胞中的核內(nèi)的p65相比較野生型鼠明顯增加,同時BV2細胞的核質(zhì)分離實驗發(fā)現(xiàn),Per2基因敲減的細胞核中p65的量顯著增加,而細胞質(zhì)中p65的量則顯著減少。結(jié)論:鐘基因Per1的缺失可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng),其作用機制可能與細胞中p65的含量減少相關(guān)。鐘基因Per2的缺失可以顯著增加LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng),其作用機制是在LPS刺激下,鐘基因Per2缺失能促使NF-κB通路中IκΒα的降解,從而促進了p65向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運,最終使炎癥因子轉(zhuǎn)錄釋放增多,促進了LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的發(fā)生。
[Abstract]:Objective : To investigate the effects of the expression of cytokines IL - 6 , TNF - 偽 , i - NOS and COX2 in the cells of rat brain by using the method of immuno - blotting . The expression of TNF - 偽 and IL - 6 in the cells was detected by ELISA . The expression of TNF - 偽 and IL - 6 in primary astrocytes after LPS - stimulated knock - out could significantly increase the expression of TNF - 偽 and IL - 6 in primary astrocytes after LPS stimulation .
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R965

【共引文獻】

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本文編號：2066686