本文選題：地龍 + 纖溶酶��； 參考：《浙江大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：本論文基于蛋白質(zhì)組學(xué)分析,第一部分是基于差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析了兩種不同干燥處理方法對(duì)地龍中藥材溶栓活性的影響。干燥的地龍作為溶栓藥物在我國(guó)已有兩千余年的歷史,關(guān)于其溶栓的有效成份及溶栓的作用機(jī)理已有較多研究。據(jù)報(bào)道,從蚯蚓體內(nèi)分離提取出的一類(lèi)纖維蛋白溶解酶(又統(tǒng)稱(chēng)蚓激酶)具有纖溶活性或纖溶酶原激活活性、能降低血小板聚集和血漿黏度,因而被認(rèn)為是地龍溶栓的活性成分。然而,纖溶酶作為蛋白質(zhì)在地龍的加工干燥過(guò)程中很可能會(huì)受溫度的影響而產(chǎn)生降解,但目前就干燥加工工藝對(duì)地龍溶栓活性的影響卻未見(jiàn)報(bào)道。因此,論文第一部分采用現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)普通干燥與冷凍干燥兩種不同加工處理的地龍進(jìn)行了比較分析,為今后我國(guó)合理加工地龍中藥材提供了一定的理論依據(jù)。論文第二部分針對(duì)特定類(lèi)別蛋白質(zhì),分析了與細(xì)胞免疫功能相關(guān)的造血絲氨酸蛋白酶的酶切特異性。來(lái)自造血干細(xì)胞的肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞以及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的顆粒體中都儲(chǔ)存著大量的蛋白酶。在肥大細(xì)胞中這些蛋白酶占據(jù)了整個(gè)細(xì)胞蛋白總量的35%,且絕大部分屬于胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶家族。目前這些免疫細(xì)胞已被證實(shí)具有多重免疫調(diào)節(jié)功能包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、血壓調(diào)節(jié)、對(duì)昆蟲(chóng)以及蛇毒的失活、清除細(xì)菌、降解細(xì)胞因子等。有關(guān)這些細(xì)胞的免疫功能調(diào)節(jié)機(jī)制到目前仍不是非常明確,但推測(cè)在很大程度上與其胞內(nèi)的高豐度絲氨酸蛋白酶相關(guān)。論文第二部分選擇了其中幾個(gè)造血絲氨酸蛋白酶,分析了它們的酶切特異性。通過(guò)對(duì)蛋白酶酶切特異性的分析可篩選出它們?cè)隗w內(nèi)的潛在底物,進(jìn)而闡明這些絲氨酸蛋白酶及其細(xì)胞的免疫功能調(diào)節(jié)機(jī)制。此外,絲氨酸蛋白酶酶切特異性的分析結(jié)合它們的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育可揭示蛋白酶及其功能在脊椎動(dòng)物中的進(jìn)化。本論文主要研究?jī)?nèi)容和創(chuàng)新性工作如下：(1)基于差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析了普通干燥與冷凍干燥兩種不同加工方法對(duì)中藥材地龍溶栓活性的影響及其機(jī)理：論文第二章首先采用纖維平板法和血塊體外溶解法分別比較分析了普通干燥與冷凍干燥兩種不同加工處理地龍的纖溶與溶栓活性。結(jié)果表明,冷凍干燥處理得到的地龍具有更強(qiáng)的溶栓活性。接著,我們采用纖維蛋白酶譜法與雙向電泳技術(shù)對(duì)這兩種不同加工處理的地龍進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果顯示,這兩種地龍的2-DE蛋白質(zhì)圖譜存在顯著的差異。共檢測(cè)到700多個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn),其中126個(gè)為差異蛋白點(diǎn)。經(jīng)MALDI-TOF/TOF-MS成功鑒定了83個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn),其中13個(gè)表現(xiàn)為上調(diào)或下調(diào),70個(gè)為新出現(xiàn)或消失的蛋白質(zhì)點(diǎn)。這些差異蛋白質(zhì)點(diǎn)中有5個(gè)被鑒定為蚯蚓纖溶酶,2-DE與纖維蛋白酶譜法一致檢測(cè)到這些纖溶酶在冷凍干燥地龍中的總豐度更高,揭示了冷凍干燥地龍具有更強(qiáng)溶栓活性的機(jī)理。綜上,本章實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析兩種不同干燥處理地龍的差異蛋白質(zhì)組學(xué),證明了冷凍干燥更有利于保護(hù)地龍中溶栓的活性成份。該研究為以后我國(guó)合理加工地龍中藥材提供了一定的理論指導(dǎo)意義。(2)基于噬菌體展示技術(shù)分析了大鼠黏膜肥大細(xì)胞蛋白酶(rMCP)-2的酶切特異性,揭示其提高腸道滲透性的機(jī)理：大鼠黏膜肥大細(xì)胞(MMCs)在腸道受到寄生蟲(chóng)感染后其數(shù)量會(huì)急劇上升。MMCs內(nèi)僅包含rMCP-2,-3,-4這三個(gè)β-糜蛋白酶,其中rMCP-2含量最高。文獻(xiàn)報(bào)道,rMCP-2可改變黏膜上皮組織以及血管內(nèi)皮的通透性,從而有利于其他炎癥細(xì)胞和血漿組份進(jìn)入腸腔。因此,推測(cè)rMCP-2很可能是MMCs提高對(duì)腸道內(nèi)寄生蟲(chóng)清除這一免疫功能的執(zhí)行者。但到目前,有關(guān)rMCP-2在腸道內(nèi)的水解底物以及其提高腸道滲透性的機(jī)理卻不清楚。論文第四章利用噬菌體展示技術(shù)與若干新型重組蛋白底物的水解分析完成了對(duì)重組rMCP-2延伸酶切特異性的分析。結(jié)果顯示,rMCP-2的水解位點(diǎn)(P1)偏向芳香族氨基酸Phe或Tyr,而水解肽鍵上下游相鄰位點(diǎn)(P4-P2和P4'-P1')則普遍偏向脂肪族氨基酸,是一個(gè)具有嚴(yán)格底物選擇特異性的糜蛋白酶,與小鼠黏膜肥大細(xì)胞內(nèi)的mMCP-1酶切特異性極為相似。根據(jù)噬菌體展示技術(shù)得到的rMCP-2理論水解序列從大鼠蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出了rMCP-2在體內(nèi)的潛在底物。這些潛在底物中,有若干與腸道或血管上皮和內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)的蛋白。通過(guò)對(duì)其中5個(gè)緊密連接蛋白的重組蛋白與活性rMCP-2的水解分析,鑒定出occludin loop 1、cadherin 17和protocadherin alpha 4能被rMCP-2高效地降解,表明至少以上三個(gè)緊密連接蛋白是rMCP-2在大鼠體內(nèi)的靶標(biāo)底物,初步揭示了rMCP-2提高腸道滲透性進(jìn)而增強(qiáng)對(duì)寄生蟲(chóng)清除的機(jī)理。(3)首次系統(tǒng)地分析比較了人類(lèi)肥大細(xì)胞糜蛋白酶與中性粒細(xì)胞組織蛋白酶G的酶切特異性：人類(lèi)糜蛋白酶(HC)與組織蛋白酶G (hCG)是兩個(gè)分別來(lái)自中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞的、極為相似的胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶。它們的編碼基因都分布在肥大細(xì)胞糜蛋白酶基因座,擁有著多種共同的水解底物。因此,人類(lèi)肥大細(xì)胞與中性粒細(xì)胞具有相似的促炎、抗炎以及抗菌等多方面的免疫功能。為了明確和區(qū)分這兩類(lèi)細(xì)胞在炎癥方面不同的免疫調(diào)節(jié)功能,論文第五章基于首次對(duì)HC與hCG進(jìn)行了系統(tǒng)地比較分析。首先,通過(guò)噬菌體展示技術(shù)與若干新型重組蛋白底物的水解分析比較了這兩個(gè)造血絲氨酸蛋白酶的酶切特異性。結(jié)果表明,hCG與HC具有非常相似的延伸酶切特異性,但HC水解序列在P1位點(diǎn)僅偏向芳香族氨基酸,而hCG P1位點(diǎn)偏向芳香族氨基酸和Leu,反映了HC比hCG具有更嚴(yán)格的糜蛋白酶樣酶切特異性。細(xì)胞因子是HC與hCG最受關(guān)注的潛在底物之一。本章實(shí)驗(yàn)分析了重組HC與hCG對(duì)50個(gè)常見(jiàn)的人類(lèi)細(xì)胞因子/趨化因子的選擇性。結(jié)果顯示,只有3個(gè)細(xì)胞因子能被重組HC高效降解,10-11個(gè)細(xì)胞因子能被重組hCG徹底降解,反映了HC與hCG對(duì)人類(lèi)細(xì)胞因子或趨化因子均具有高度的選擇性,但HC對(duì)細(xì)胞因子的選擇性更強(qiáng)。這些被高效降解的細(xì)胞因子在很大程度上可被認(rèn)為是HC或hCG在體內(nèi)的潛在靶標(biāo)底物,因此上述結(jié)果直接反映了HC與hCG在炎癥反應(yīng)方面不同的調(diào)節(jié)作用。(4)首次對(duì)負(fù)鼠糜蛋白酶基因座的蛋白酶grathepsodenase的酶切特異性進(jìn)行了分析,揭示顆粒酶B在哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)中的進(jìn)化：Gzm B在哺乳動(dòng)物體內(nèi)主要參與誘導(dǎo)半胱天冬酶依賴性的細(xì)胞凋亡,是抵抗病毒和胞內(nèi)細(xì)菌的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一。為了鑒定Gzm B的天冬氨酸蛋白酶活性在脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)中的進(jìn)化,闡明半胱天冬酶依賴性細(xì)胞凋亡機(jī)制在抵抗胞內(nèi)寄生蟲(chóng)和癌細(xì)胞中比非依賴性的細(xì)胞凋亡更為重要,論文第六章首次對(duì)最原始的非胎盤(pán)類(lèi)哺乳動(dòng)物——美國(guó)負(fù)鼠Monodelphis domestica中一個(gè)類(lèi)似Gzm B的蛋白酶grathepsodenase進(jìn)行了分析。利用HEK 293 EBNA細(xì)胞表達(dá)合成了該重組蛋白酶,并通過(guò)顯色底物與新型重組蛋白底物分別分析了grathepsodenase的初級(jí)與延伸酶切特異性。結(jié)果表明,負(fù)鼠grathepsodenase偏向在帶負(fù)電荷氨基酸的羧基端發(fā)生水解,與人類(lèi)Gzm B具有相似的酶切特異性,屬于Gzm B同系物。然而,負(fù)鼠Gzm B比人類(lèi)Gzm B具有更廣泛的初級(jí)與延伸酶切特異性。非胎盤(pán)類(lèi)哺乳動(dòng)物中Gzm B同系物的發(fā)現(xiàn)暗示著天冬氨酸蛋白酶誘導(dǎo)的半胱天冬酶依賴性細(xì)胞凋亡至少在早期哺乳動(dòng)物時(shí)期就已出現(xiàn)并成為哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)的組成部分。同時(shí),負(fù)鼠Gzm B的發(fā)現(xiàn)也說(shuō)明了糜蛋白酶和Gzm B是肥大細(xì)胞糜蛋白酶基因座上兩個(gè)最早出現(xiàn)的絲氨酸蛋白酶基因。
[Abstract]:On the basis of proteomic analysis , the first part is based on the differential proteomic analysis of the effect of two different drying methods on the thrombolytic activity of the traditional Chinese medicinal materials . The results showed that rMCP - 2 could be used to improve intestinal permeability and enhance intestinal permeability . The results showed that rMCP - 2 could be used to improve intestinal permeability and enhance intestinal permeability . The results showed that rMCP - 2 could be used to improve intestinal permeability and enhance intestinal permeability . In order to identify the evolution of Gzm B in mammalian immune system , it is suggested that the mechanism of Gzm B plays a role in inducing caspase - dependent apoptosis in mammalian immune system .
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R915

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2065477