本文選題：魯米諾 + β-環(huán)糊精��； 參考：《第三軍醫(yī)大學》2016年博士論文

【摘要】：響應性納米材料的設計和合成一直是納米醫(yī)學關注的熱點問題。納米載體不僅具有改善藥物組織分布,影響藥物體內(nèi)代謝的特點,還能實現(xiàn)診斷、治療等功能的一體化。但如何使藥物能夠特異性的分布于病灶和靶標部位,就需要更加有效的遞送策略。自上世紀70年代首次提出響應性納米遞送系統(tǒng)的理念后,已有大量實驗和應用研究取得了諸多進展。利用溫度、磁場、光照等外源性刺激和pH、酶、氧化還原系統(tǒng)等諸多內(nèi)源性物質(zhì)的改變,使藥物及成像、診斷試劑能夠特異性的分布和富集于靶標部位,用于諸如炎癥、心血管功能障礙及腫瘤等多類疾病的診斷和治療。當前研究中,外源性信號響應性納米遞送系統(tǒng)因需施加后續(xù)外源性干預,過程相對較為繁瑣,長期應用性也較為困難;而在內(nèi)源性信號響應性納米遞送系統(tǒng)中,基于疾病微環(huán)境改變,具備診斷和治療功能的納米材料,雖多有研究,但同時具有酶響應性無創(chuàng)成像能力,且具備治療特性的納米遞送系統(tǒng)亦鮮有報道�；谝陨蠁栴},本課題提出設想:以小分子發(fā)光物質(zhì)魯米諾(luminol)為功能單元,將其鍵合于FDA批準的生物相容性分子β-環(huán)糊精(β-cyclodextrin,β-CD),可以得到髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)響應性的化學發(fā)光材料bCD-Lu;以其制備化學發(fā)光納米粒(Nanoparticle,NP),用于炎癥的無創(chuàng)成像。為驗證此假設,在成功合成bCD-Lu的基礎上,對其納米粒的理化性能和體外發(fā)光特性進行了深入表征。同時,基于多種急性炎癥模型對bCD-Lu納米粒的體內(nèi)成像功能進行了深入評價,并在多種炎癥模型中研究了其治療效果。由此,成功構(gòu)建了具有MPO響應性的多功能納米遞送系統(tǒng)。方法1.Luminol鍵合β-CD功能材料bCD-Lu的合成稱取0.68 gβ-CD和0.68 g N,N'-carbonyldiimidazole(CDI)于圓底燒瓶中,加入6m L無水DMF溶解并以N2保護,室溫下攪拌1.5 h后,將反應混合物緩慢加入4℃無水乙醚中沉淀,抽濾后,將沉淀重新加入8 m L無水DMF中溶解,并稱取0.318 g luminol加入其中,室溫下攪拌反應15 h。隨后,將產(chǎn)物緩慢加入蒸餾水中沉淀,8500 rpm離心6 min,棄去上清液,加入25 m L蒸餾水渦旋清洗2次、并離心收集,冷凍干燥2天,得bCD-Lu白色粉末。2.bCD-Lu及水解產(chǎn)物的表征取bCD-Lu溶于DMSO-d6,掃描核磁氫譜和碳譜;取bCD-Lu粉末適量,設定分辨率16 cm-1,掃描次數(shù)4次,測試范圍650-4000 cm-1掃描紅外光譜;將bCD-Lu溶于1 M Na_2CO_3溶液,加入H_2O_2后200-800 nm掃描化學發(fā)光光譜;將bCD-Lu分別溶于1 M Na_2CO_3溶液和DMSO中,掃描紫外光譜。bCD-Lu溶解于1 M Na_2CO_3溶液反應2h,丙酮沉淀后,溶于DMSO-d6,掃描核磁氫譜。3.bCD-Lu納米粒(bCD-Lu NP)的制備和表征將bCD-Lu 50.0 mg,加入2 m L DMF攪拌溶解,緩慢加入10 m L蒸餾水,室溫下攪拌2 h后,12000 rpm離心10 min,棄去上清,加入2 m L蒸餾水水洗3次后得bCD-Lu NP。少量水分散后,采用透射電子顯微鏡觀察納米粒形態(tài),并測定其粒徑和電位。4.bCD-Lu NP在不同pH和不同濃度H_2O_2溶液中的穩(wěn)定性取bCD-Lu NP溶液加入pH 1.0~14的水解介質(zhì)中,500 nm處測定溶液的透光率,并收集相應時間點的水解數(shù)據(jù)。另取納米粒溶液加入含有1~800 m M H_2O_2的水解介質(zhì)中,測定不同時間點500 nm處的透光率。5.H_2O_2濃度對bCD-Lu NP化學發(fā)光光譜和強度的影響在石英比色皿中加入bCD-Lu NP和魯米諾鈉鹽(luminol-Na)后,加入0~100 m M不同濃度的H_2O_2,掃描bCD-Lu NP化學發(fā)光光譜。在透明光學玻璃樣品池中加入bCD-Lu NP和luminol-Na,加入0~10 m M H_2O_2,微弱發(fā)光測量儀測定發(fā)光強度-時間變化曲線。6.MPO和Cl~-水平對bCD-Lu NP化學發(fā)光光譜和強度的影響在石英比色皿中和玻璃樣品池中加入bCD-Lu NP和luminol-Na后,按照方案PBS+H_2O_2,PBS+MPO+H_2O_2和MPO+NaCl+H_2O_2加入MPO、Cl~-,隨后加入H_2O_2觀察納米粒的化學發(fā)光光譜變化并記錄強度-時間變化曲線。以同樣的方法測定NaCl O對bCD-Lu NP發(fā)光行為的影響,其中NaClO的濃度在0~1 m M之間。7.bCD-Lu NP濃度對其化學發(fā)光光譜和強度的影響將0~6 mg/m L的bCD-Lu NP樣品加入等體積的1 m M H_2O_2后觀察納米粒的化學發(fā)光光譜變化;移取0~10 mg/m L的bCD-Lu NP溶液于樣品池中,加入等體積的10 m M H_2O_2,測定納米粒發(fā)光強度變化。8.MPO抑制劑和活性氧清除劑對bCD-Lu NP發(fā)光強度的影響在樣品池中加入bCD-Lu NP后,加入等體積MPO和1~10μM MPO抑制劑對氨基苯甲酰肼(4-Aminobenzoic acid hydrazide,4-ABAH)或0~1000μM活性氧清除劑哌啶醇氧化物(4-Hydroxy-TEMPO,TEMPOL),隨后,加入等體積的10 m M H_2O_2測定bCD-Lu NP發(fā)光強度的變化。9.孔板成像考察H_2O_2對bCD-Lu NP發(fā)光特性的影響吸取bCD-Lu NP溶液于黑色96孔板中,分別加入0~1 m M H_2O_2樣品溶液,共12孔,隨后,以IVIS成像系統(tǒng)測定化學發(fā)光強度,其中曝光時間為5 min。10.孔板成像考察MPO、Cl~-及bCD-Lu NP濃度對其發(fā)光行為的影響在黑色96孔板中加入bCD-Lu NP,將0~100 m U/m L的MPO溶液或0~200 m M Na Cl+200 m U/m L MPO溶液移入孔板,隨后,加入200μM H_2O_2以相同條件進行IVIS成像。吸取0~10 mg/m L bCD-Lu NP溶液于黑色96孔板中,加入1 m M H_2O_2后立即成像。11.孔板成像研究MPO抑制劑和活性氧清除劑對bCD-Lu NP發(fā)光的影響在黑色96孔板中加入bCD-Lu NP后,加入等體積MPO和0~10.24μM 4-ABAH或0~40μM TEMPOL,隨后,加入等體積200μM H_2O_2記錄bCD-Lu NP發(fā)光強度值。12.bCD-Lu NP在中性粒細胞中的發(fā)光行為研究Balb/c小鼠腹腔注射3%巰基乙酸鹽溶液,4 h后處死小鼠,腹腔注射HBSS,5 min后,抽取腹腔灌洗液,離心棄上清,HBSS清洗2次,重懸獲得中性粒細胞。12孔板每孔接種5.0×10~5細胞,加入佛波酯刺激,1 h后,分別加入bCD-Lu NP和luminol-Na成像,通過IVIS系統(tǒng)成像。13.bCD-Lu NP在足趾腫脹模型中的成像功能評價取Balb/c小鼠,于左后側(cè)足趾部位局部注射0.2%角叉菜膠溶液建立模型,造模6h后,分別局部注射bCD-Lu NP和lumiol-Na(含量按luminol單元計算為0.75 mg/kg),并采用IVIS進行成像。隨后,以地塞米松(Dexamethasone,DEX)干預模型,再次觀察納米粒的成像效果。14.bCD-Lu NP在腹膜炎模型中的成像效果研究取Balb/c小鼠腹腔注射0.1%脂多糖建立模型,6 h后,腹腔注射bCD-Lu NP和lumiol-Na(含量按luminol計算為7.5 mg/kg),并進行IVIS成像。此外,Balb/c小鼠腹腔注射0.1%脂多糖,3%巰基乙酸鹽或0.1%酵母多糖溶液建立腹膜炎模型。6 h后,注射0.5 m L bCD-Lu NP(按luminol單元劑量為7.5 mg/kg),進行IVIS成像,并測定小鼠腹腔灌洗液中中性粒細胞的比例。以0.1%酵母多糖為刺激物建立腹膜炎模型,測定模型小鼠腹腔灌洗液中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)白介素-1β(IL-1β)的水平。隨后給予bCD-Lu NP,觀察發(fā)光強度隨時間的變化;同時測定腹腔灌洗液中中性粒細胞比例、MPO和活性氧(ROS)含量。此后,分別在成像前注射500μM 4-ABAH和12.8μM TEMPOL,考察抑制劑對發(fā)光強度的影響。15.bCD-Lu NP在急性肺損傷模型中的發(fā)光行為研究取Balb/c小鼠通過鼻腔呼吸道吸入0.1%脂多糖溶液建立急性肺損傷模型,6 h后,尾靜脈注射bCD-Lu NP和lumiol-Na(含量按luminol計算為3 mg/kg),進行IVIS成像。并取PBS肺部灌洗液和肺組織測定MPO、ROS、TNF-α和IL-1β的含量。隨后,建立0~24 h不同時間點肺損傷模型,給予bCD-Lu NP(含量按luminol計算為3 mg/kg),考察發(fā)光強度和炎癥進程的關系,同時測定肺組織中性粒細胞比例以及MPO和ROS含量。16.bCD-Lu NP在結(jié)腸炎模型中的成像效果評價取C57BL/6J小鼠給予3%葡聚糖硫酸酯鈉鹽(DSS)水溶液建立結(jié)腸炎模型,于模型建立第1,3,7天后,直腸給予bCD-Lu NP進行IVIS成像,并同時測定結(jié)腸部位MPO和ROS含量。17.載DEX的bCD-Lu NP對小鼠足趾腫脹治療作用的評價制備負載DEX的bCD-Lu納米粒(DEX/bCD-Lu NP),同時選擇聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)為對照材料制備負載DEX的納米粒(DEX/PLGA NP),對其進行表征。取Balb/c小鼠,測厚儀測量小鼠足趾部位厚度,于左后側(cè)足趾部位局部注射0.2%角叉菜膠溶液建立模型。造模0.5 h后,給予DEX/bCD-Lu NP和DEX/PLGA NP(按DEX劑量為2.5 mg/kg)。6 h后,測量小鼠足趾厚度,同時收集成像圖片。此后,小鼠足趾部位給予50μL luminol-Na溶液,再次進行成像。18.DEX/bCD-Lu NP對小鼠腹膜炎治療作用的評價取Balb/c小鼠腹腔注射0.1%酵母多糖建立模型,0.5 h后,腹腔注射給予DEX/bCD-Lu NP和DEX/PLGA NP(按DEX劑量計算為2.5 mg/kg)進行干預。6 h后,取腹腔灌洗液測定其中中性粒細胞比例以及MPO、ROS、TNF-α和IL-1β的水平。19.DEX/bCD-Lu NP對小鼠急性肺損傷治療作用的研究取Balb/c小鼠,通過鼻腔呼吸道吸入0.1%脂多糖溶液建立急性肺損傷模型,0.5 h后,尾靜脈注射DEX/bCD-Lu NP和DEX/PLGA NP(按DEX劑量計算為2.5 mg/kg)進行干預。12 h后,取肺組織灌洗液測定其中中性粒細胞比例以及MPO、ROS、TNF-α和IL-1β含量。同時測定肺組織中炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達水平。20.bCD-Lu NP對小鼠動脈粥樣硬化的治療作用評價取載脂蛋白E缺陷(Apo E-/-)小鼠,喂養(yǎng)高脂飼料(5%豬油和0.25%膽固醇)建立動脈粥樣硬化模型,1月后,腹腔注射給予Cy7.5標記的bCD-Lu納米粒(Cy7.5/bCD-Lu NP),給藥12天后處死小鼠,剝離主動脈進行IVIS成像觀察納米粒在主動脈斑塊部位的富集情況。治療實驗中,給予高脂飲食1月后,腹腔注射給予生理鹽水和bCD-Lu NP(30 mg/kg)直至實驗結(jié)束,每隔3天給藥一次,記錄小鼠體重變化。3個月后,取小鼠全血和血清測定血常規(guī)、血脂和肝腎功能指標,同時測定小鼠血清炎癥因子。取小鼠主動脈至腹主動脈分叉段,0.3%油紅O染色,尼康Nis-Elements BR3.2軟件統(tǒng)計斑塊面積。此外,以組織消化液消化主動脈,加入V450抗CD11b和PE抗Ly6G小鼠抗體,流式細胞儀測定主動脈組織中中性粒細胞含量。另外,取主動脈根部冰凍切片,進行Masson染色,并與α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和CD68抗體分別進行孵育染色,以軟件統(tǒng)計相應面積。21.bCD-Lu NP的細胞毒性評價于96孔板中每孔加入1×105巨噬細胞RAW264.7或乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞,加入濃度為3.9~1μg/m L的bCD-Lu NP溶液。孵育24 h后,加入培養(yǎng)基90μL和MTT 10μL,酶標儀490 nm除測定吸光度值,計算細胞存活率。22.bCD-Lu NP的初步體內(nèi)安全性評價昆明小鼠稱重后,尾靜脈注射給予600 mg/kg bCD-Lu NP。注射后,每2天記錄體重,觀察其基本生命體征。15天后,小鼠處死后取血樣測定血常規(guī),并取血清,測定谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肌酐和尿素肝腎功指標。并取小鼠主要臟器,計算臟器指數(shù),同時進行組織病理學分析。結(jié)果1.基于β-CD和luminol合成了功能材料bCD-Lu,并對材料進行了紅光光譜、核磁氫譜和碳譜表征,其水解產(chǎn)物核磁氫譜顯示β-CD與luminol的摩爾比為1:1。與luminol化學發(fā)光光譜和紫外光譜相比,材料的最大發(fā)射峰和吸收峰沒有發(fā)生位移。2.通過納米沉淀法制備了發(fā)光納米粒bCD-Lu NP,其粒徑為220 nm,Zeta電位為-25 m V。3.bCD-Lu NP在pH2或9.2溶液中能夠快速分解,伴隨H_2O_2濃度的增高,其水解逐漸加快。當H_2O_2濃度提高至50 m M時,納米�？焖偎�,1.5 h后,溶液透光率即提高至23%。4.與luminol-Na相比,bCD-Lu NP在H_2O_2溶液中的化學發(fā)光光譜未發(fā)生變化,最大發(fā)射峰位置與luminol-Na一致;而在相同條件下,bCD-Lu NP的發(fā)光強度和持續(xù)時間均顯著增加;隨雙氧水濃度的提高,bCD-Lu NP的發(fā)光強度具有H_2O_2響應性,與H_2O_2濃度成正相關。5.bCD-Lu NP溶液的光譜學研究和孔板成像結(jié)果顯示,逐一加入MPO和Cl-后,發(fā)光強度逐步升高,并具有突躍性,強度升高程度和MPO以及Cl-濃度成依賴性,最大發(fā)射峰位置未發(fā)生改變。納米粒溶液在加入NaClO溶液后,發(fā)光強度升高,強度與NaClO濃度呈正相關。6.bCD-Lu NP溶液的化學發(fā)光強度變化呈現(xiàn)濃度依賴性,納米粒濃度升高,發(fā)光強度逐漸增大,最大發(fā)射峰位置不變。7.bCD-Lu NP溶液的發(fā)光強度在加入MPO抑制劑4-ABAH和ROS清除劑TEMPOL后,受到顯著抑制,表明其發(fā)光具有MPO和ROS響應性。8.bCD-Lu NP在小鼠足趾腫脹模型中具有良好的成像功能,與luminol相比,其成像具有緩慢增加,不斷增強的趨勢,具有顯著延長的小鼠體內(nèi)成像時間;而在DEX干預后,成像效果受到明顯抑制,說明納米粒的成像與炎癥的程度息息相關。9.bCD-Lu NP在腹膜炎模型中的成像效果良好,其發(fā)光時間延長的結(jié)果與足趾腫脹模型一致。在脂多糖、巰基乙酸鹽和酵母多糖三種刺激物誘導的小鼠腹膜炎模型中,納米粒的發(fā)光與腹腔灌洗液中的中性粒細胞數(shù)呈顯著正相關,R值為0.99。酵母多糖誘導的小鼠腹膜炎中,成像時間點考察結(jié)果與腹腔灌洗液中中性粒細胞比例及MPO、ROS含量呈現(xiàn)明顯的相關性;而在加入抑制劑4-ABAH和TEMPO后,動物體內(nèi)發(fā)光受到抑制,亦證明bCD-Lu NP的體內(nèi)發(fā)光具有MPO和ROS依賴性和響應性。10.在小鼠急性肺損傷模型中,bCD-Lu NP成像表現(xiàn)出獨特的優(yōu)點,與其相比,luminol組均無明顯的發(fā)光。通過在不同時間點對肺損傷小鼠進行在體成像,并測定肺組織中的中性粒細胞比例及MPO、ROS含量,結(jié)果顯示,發(fā)光強度與后者表現(xiàn)出依賴性和響應性。11.bCD-Lu NP在小鼠結(jié)腸炎模型中亦表現(xiàn)出一定的發(fā)光特性,強度相對較弱;但通過測定結(jié)腸部位MPO和ROS含量,亦發(fā)現(xiàn),其發(fā)光強度和二者變化趨勢一致。12.通過納米沉淀法制備了載藥納米粒DEX/bCD-Lu NP和DEX/PLGA NP,粒徑分別為240和190 nm,Zeta電位為-30和-36 m V。在小鼠足趾腫脹模型中,通過測定小鼠足趾腫脹厚度及成像結(jié)果表明,DEX/bCD-Lu NP具有良好的治療效果,且證明了bCD-Lu NP同時具有成像和藥物遞送功能。13.DEX/bCD-Lu NP能夠有效抑制小鼠腹膜炎的進展,在納米粒治療組,腹腔灌洗液中的中性粒細胞比例、MPO、ROS及炎癥因子TNF-α和IL-1β都有顯著性降低。14.在小鼠急性肺損傷模型的治療研究中,DEX/bCD-Lu NP也表現(xiàn)出良好的治療效果。通過測定肺灌洗液中的中性粒細胞比例、MPO、ROS及炎癥因子TNF-α和IL-1β的含量,以及肺組織中TNF-α和IL-1β的水平,結(jié)果均表明,上述細胞和因子都有顯著性降低。15.在基于Apo E-/-小鼠動脈粥樣硬化模型的治療研究中,主動脈油紅染色結(jié)果表明,在納米粒干預組,斑塊面積有所減少,和對照組相比,有顯著性差異。中性粒細胞流式分析以及冰凍切片免疫組化染色結(jié)果表明,在納米粒干預組,中性粒細胞數(shù)和MPO水平均有所減少。冰凍切片巨噬細胞和斑塊膠原染色統(tǒng)計結(jié)果表明納米粒能夠有效提高斑塊的穩(wěn)定性。上述結(jié)果說明bCD-Lu NP對動脈粥樣硬化具有較好的治療效果。16.初步bCD-Lu NP的細胞毒性和小鼠急性毒性試驗結(jié)果顯示,bCD-Lu NP具有良好的體內(nèi)外安全性。在600 mg/kg劑量下,動物體重、臟器指數(shù)、血常規(guī)及肝腎功等指標與對照組相比,無顯著性差異。結(jié)論1.成功合成了髓過氧化物酶響應性化學發(fā)光材料bCD-Lu,并制備了相應的納米粒;共價鍵結(jié)合后,bCD-Lu的發(fā)光行為未發(fā)生變化,H_2O_2、MPO和Cl-能顯著提高納米粒的化學發(fā)光強度;MPO抑制劑和ROS清除劑能顯著抑制bCD-Lu NP的發(fā)光強度,故納米粒的發(fā)光特性具有明顯的MPO和ROS響應性。與luminol相比,bCD-Lu NP具有顯著增強的發(fā)光強度和明顯延長的發(fā)光時間。2.bCD-Lu NP能夠在小鼠足趾腫脹模型中進行在體成像,且發(fā)光強度能夠被DEX抑制,納米粒的發(fā)光強度可以反映炎癥的發(fā)展程度;bCD-Lu NP在小鼠腹膜炎、急性肺損傷和結(jié)腸炎模型中的發(fā)光強度與中性粒細胞數(shù)以及MPO和ROS的水平相關,具有MPO和ROS依賴性,故bCD-Lu NP的化學發(fā)光強度能夠反映炎癥初期的進展情況。3.bCD-Lu NP能夠負載抗炎藥物DEX,DEX/bCD-Lu NP在小鼠足趾腫脹、腹膜炎和急性肺損傷模型中,呈現(xiàn)良好的治療效果,能顯著減少疾病部位中性粒細胞的浸潤、降低MPO、ROS及炎癥因子TNF-α和IL-1β的水平。4.bCD-Lu NP通過降低主動脈斑塊部位中性粒細胞數(shù),減少斑塊部位巨噬細胞數(shù)量,增加膠原含量,可以有效減小動脈粥樣硬化斑塊面積、并提高斑塊穩(wěn)定性。5.初步體內(nèi)外評價表明bCD-Lu NP具有良好的安全性。綜上所述,本論文基于β-CD和發(fā)光物質(zhì)luminol合成了功能性載體材料bCD-Lu,并以其構(gòu)建了MPO和ROS響應性的發(fā)光納米載體�；诠庾V測定、孔板成像、細胞成像以及活體成像和治療等實驗,證明了bCD-Lu NP在急性炎癥中的成像功能和抗炎活性,為檢測炎癥的發(fā)生發(fā)展以及治療提供了新的手段。此外,bCD-Lu NP的發(fā)光特性和抗炎效果具有中性粒細胞、MPO和ROS依賴性和響應性,為相關疾病診斷新試劑和治療新藥物的設計提供了新的思路。
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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R943;TB383.1
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本文編號：2035999