本文選題：LC-MS/MS + 藥代動(dòng)力學(xué)�。� 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：磷酸二酯酶-4 (phosphodiesterase 4, PDE4)作為抑郁癥和阿爾茨海默病等疾病的潛在靶點(diǎn)已經(jīng)研究了二十多年,PDE4抑制劑的開(kāi)發(fā)也為這類(lèi)疾病的治療提供一定可能。但由于PDE4抑制劑嚴(yán)重的胃腸道不良反應(yīng),如惡心、嘔吐等阻礙了這一類(lèi)藥物的進(jìn)一步研究。如何減輕PDE 4抑制劑的不良反應(yīng)又同時(shí)保持其藥理活性是這一類(lèi)藥物開(kāi)發(fā)的難點(diǎn)。本課題組通過(guò)對(duì)經(jīng)典的PDE 4抑制劑進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,成功地合成出了一系列化合物。通過(guò)酶活性測(cè)試我們從中篩選出了一個(gè)具有代表性的化合物,(2-((3'-chloro-6-methoxy-[1,1'-biphenyl]-3-yl) methyl)-6-((2-(2-methoxyphenoxy) ethyl) amino) pyridazin-3 (2H)-one (Chlorbipram,氯比普蘭)。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)：1、氯比普蘭在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)PDE 4具有良好的抑制作用,且在120 min的觀察期內(nèi)比格犬無(wú)嘔吐反應(yīng)；2、氯比普蘭對(duì)不同抑郁模型動(dòng)物(如急性抑郁模型小鼠、慢性不可預(yù)期溫和刺激模型大鼠)所表現(xiàn)出的焦慮和抑郁樣癥狀有明顯的改善作用；3、氯比普蘭能一定程度逆轉(zhuǎn)老年小鼠和由Aβ25-35誘導(dǎo)的AD模型大鼠所表現(xiàn)出的認(rèn)知功能障礙。因此,氯比普蘭具有很好的開(kāi)發(fā)前景。然而一個(gè)候選化合物能否脫穎而出,成功上市,除了要依賴(lài)于藥理毒理學(xué)效應(yīng),它的藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布等性質(zhì)也十分重要。這直接影響到新化合物的用藥安全性和可靠性。所以,我們?cè)谂R床前對(duì)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)及組織分布等情況進(jìn)行系統(tǒng)的研究是非常必要的,它能提供藥物在動(dòng)物體的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、分布、代謝和排泄(ADME)等信息,為臨床上預(yù)測(cè)人體內(nèi)的ADME信息、確定給藥劑量等提供參考。本課題主要針對(duì)新型PDE4抑制劑氯比普蘭進(jìn)行臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究,并對(duì)劑量與相應(yīng)的藥動(dòng)參數(shù)之間的相關(guān)性進(jìn)行研究,計(jì)算口服給予氯比普蘭后在動(dòng)物體內(nèi)吸收的絕對(duì)生物利用度,同時(shí)根據(jù)所測(cè)得的氯比普蘭在血漿和腦組織中的分布情況,考察氯比普蘭是否可以透過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織,如若可以,則考慮其在腦內(nèi)亞區(qū)的具體分布情況。一、生物樣品中氯比普蘭UFLC-MS/MS分析方法的建立本研究建立了靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)的超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UFLC-MS/MS)的分析方法,測(cè)定生物樣品(昆明小鼠血漿和腦組織、SD大鼠血漿和腦組織)中氯比普蘭的濃度。實(shí)驗(yàn)選用氯比普蘭的類(lèi)似物ZXI14為內(nèi)標(biāo),乙酸乙酯萃取。采用Waters UPLC Acquity BEH C18柱(2.1mmx50mm,1.7μm),柱溫40℃,流動(dòng)相采用水-甲醇進(jìn)行梯度洗脫,流速為0.25 mL·min-1,進(jìn)樣量5μ1,分析時(shí)間5 min。氯比普蘭和ZX114在正離子模式下,選用電噴霧離子源(ESr),掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)multiple reaction monitoring, MRM);進(jìn)一步優(yōu)化質(zhì)譜條件后,用于定量的離子通道分別為m/z 492.6→231.3(氯比普蘭)和m/z 452.8→191.2(內(nèi)標(biāo),ZX114),響應(yīng)較強(qiáng)且背景噪音低。在昆明小鼠樣品中氯比普蘭的分析考察,血漿中的線性范圍為0.5-200ng/ml,腦組織中的線性范圍為0.25-100 ng/g,均呈良好的線性；日間和日內(nèi)精密度(RSD)在13.0%以?xún)?nèi)；提取回收率在78.0%-84.8%之間；基質(zhì)效應(yīng)在91.0%-101.5%之間,表明小鼠血漿和腦組織樣品中的基質(zhì)不影響氯比普蘭的測(cè)定；氯比普蘭和內(nèi)標(biāo)ZX114的空白血漿加標(biāo)樣品在短期、長(zhǎng)期、凍融條件下均穩(wěn)定,不影響測(cè)定。同樣,方法所建立的SD大鼠血漿線性范圍為0.5-500ng/ml,腦組織樣品的線性范圍為0.25-100 ng/g,均線性良好；日間和日內(nèi)精密度(RSD)在11.7%以?xún)?nèi)；兩種樣品經(jīng)乙酸乙酯液液萃取后的提取回收率在77.7%-86.0%之間；基質(zhì)效應(yīng)在93.8%-101.8%之間,不影響測(cè)定；并且,大鼠血漿和腦組織樣品的各穩(wěn)定性考察均符合要求,說(shuō)明該方法的穩(wěn)定、可靠。方法學(xué)評(píng)價(jià)的結(jié)果表明,所建立的生物樣品中氯比普蘭分析方法的專(zhuān)屬性、線性范圍、精密度和準(zhǔn)確度、回收率和基質(zhì)效應(yīng)等均符合生物樣品的分析要求,且方法簡(jiǎn)便,靈敏度高,重現(xiàn)性好,可用于各生物樣品中氯比普蘭的含量測(cè)定。二、氯比普蘭在昆明小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和腦組織分布研究實(shí)驗(yàn)采用180只健康、成年雄性昆明小鼠,將其分成4組,分別灌胃給予氯比普蘭低劑量、中劑量、高劑量(2.4 mg/kg、3.6 mg/kg、5.4mg/kg),尾靜脈注射給藥0.6 mg/kg,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只小鼠,在給藥后不同時(shí)間點(diǎn)取血和腦組織樣本,預(yù)處理后,用所建立的氯比普蘭分析方法測(cè)定不同劑量和不同給藥方式下昆明小鼠血漿和腦組織中的藥物濃度。建立氯比普蘭血藥濃度-時(shí)間曲線和腦組織濃度-時(shí)間曲線,然后采用非房室模型法估算氯比普蘭在小鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù),通過(guò)藥動(dòng)參數(shù)計(jì)算口服給藥后氯比普蘭的絕對(duì)生物利用度；比較相同給藥劑量下血漿和腦組織樣品分布曲線圖,評(píng)價(jià)氯比普蘭透過(guò)血腦屏障的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,昆明小鼠單劑量口服氯比普蘭(2.4,3.6,5.4mg/kg)后,其在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Cmax分別為11.3±2.0,28.5±3.5,30.5±7.3 ng/ml; tmax分別為12.0±4.5,15.0,15.0]min; t1/2分別為58.8±29.4,55.9±18.3,96.9±45.3min; AUC0-t分別為635.1±85.5,948.7±179.8,1628.0±270.5ng min/ml。氯比普蘭在小鼠體內(nèi)吸收的相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與給藥劑量基本呈線性相關(guān),如在2.4 mg/kg-5.4 mg/kg范圍內(nèi),AUC0-t與劑量呈線性相關(guān)(R2= 0.991), Cmax也與劑量呈一定的相關(guān)性(R2=0.729),這說(shuō)明該藥物在小鼠體內(nèi)的吸收基本呈線性動(dòng)力學(xué)特征,存在一定的劑量依賴(lài)性。小鼠單劑量靜注氯比普蘭(0.6 mg/kg)后,經(jīng)過(guò)擬合,其在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Cmax、t1/2、AUC0-t分別為159.6±26.5ng/ml,45.9±5.7min,4172.9±349.0 ng min/ml。通過(guò)將口服給藥不同劑量的藥時(shí)曲線下面積AUC0-t與換算后的經(jīng)靜注給藥后的AUC0-t相比,計(jì)算得到氯比普蘭在低劑量、中劑量和高劑量口服給藥后的絕對(duì)生物利用度分別為3.8±0.4%,3.8±0.8%和4.4±1.0%,生物利用度較低。兩種給藥方式給予小鼠氯比普蘭后,在腦組織中均能檢測(cè)到分布。單劑量灌胃給予氯比普蘭(2.4、3.6、5.4mg/kg)后,同樣采用非房室模型法進(jìn)行估算,在小鼠腦組織中藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下：tmax分別為17±7.6、1-2.2、27±6.7 min；t1/2分別為147.3±39.3、69.2±47.2、81.1±14.0min; Cmax分別為4.73±0.53、4.660±0.78、9.4±0.6 ng/g。小鼠尾靜脈注射氯比普蘭(0.6mg/kg)后,腦組織中藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)：tmax為10 min；t1/2為47.2±8.5in; Cmax為83.5±11.0ng/g。這些參數(shù)中值得注意的是,單劑量靜注氯比普蘭(0.6 mg/kg)后,tmax為10 min左右,比在血漿中的達(dá)峰時(shí)間有所延遲,存在一定的吸收過(guò)程,峰值濃度為83.5±11.0 ng.mL-1,提示氯比普蘭可以透過(guò)血腦屏障。同樣的,口服給予三個(gè)劑量氯比普蘭后,其在小鼠腦組織中均能檢測(cè)到有分布,且吸收和分布的曲線趨勢(shì)與血漿中的相一致,再次提示氯比普蘭可以透過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織。三、氯比普蘭在SD大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及腦分區(qū)研究實(shí)驗(yàn)首先采用18只雄性SD大鼠,將其分成3組,分別口服給予氯比普蘭2mg/kg、4mg/kg,靜注給藥1 mg/kg,在給藥后的不同時(shí)間點(diǎn)取血,同樣用第一部分所建立的分析方法測(cè)定大鼠血漿中的藥物濃度。建立相應(yīng)的血藥濃度-時(shí)間曲線,采用非房室模型法估算大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)并計(jì)算口服給藥后的絕對(duì)生物利用度。另取18只雄性SD大鼠,分成3組,3組均口服給予氯比普蘭4 mg/kg,分別選取吸收相、消除相和達(dá)峰時(shí)間共三個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死,在冰上取其海馬、前額皮質(zhì)、紋狀體及剩余大腦組織,測(cè)定不同部位腦組織中的氯比普蘭濃度。結(jié)果表明,SD大鼠單劑量口服氯比普蘭(2 mg/kg和4 mg/kg)后,氯比普蘭在SD大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Cmax分別為14.1±1.3,28.5±5.4 ng/ml; tmax為32.5±6.1,30 min; t1/2分別為175.2±45.6,105.6±38.3min, AUC0-t分別為1973.6±170.1,2866.0±534.9 ng min/ml。單劑量靜注氯比普蘭(1mg/kg)后,其在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Cmax、t1/2、AUC0-t分別為394.18±52.47 ng/ml, 37.38±10.0 min and 13885.1±1031.3 ng min/ml。以SD大鼠單劑量靜注氯比普蘭(1mg/kg)后體內(nèi)血藥濃度-時(shí)間曲線下面積為參比,計(jì)算口服氯比普蘭(2mg/kg、4 mg/kg)后的絕對(duì)生物利用度,結(jié)果分別為7.1±0.8%和5.0±0.8%。在大鼠腦內(nèi)亞區(qū)分布的結(jié)果表明,氯比普蘭的確可以進(jìn)入腦組織,且在前額皮質(zhì)中與海馬中的分布較多,而在紋狀體中則相對(duì)較少,表明氯比普蘭在SD大鼠腦內(nèi)的分布有一定的靶向性。
[Abstract]:PDE4 inhibitors have been successfully developed for the treatment of depression and Alzheimer ' s disease . In the previous experiment , the inhibition of PDE 4 was observed in the experiment of 1 , 2 - chloro - 2 - chlorobipran in vitro , and the Beagle dogs had no vomiting during the observation period of 120 min .
2 . There was a significant improvement in the symptoms of anxiety and depressive symptoms in different depressive model animals ( such as acute depression model mice , chronic unpredictable mild stimulation model rats ) .
In this study , it is necessary to study the pharmacokinetics and tissue distribution of the new PDE4 inhibitor . The linear range of plasma was 0.5 -200ng / ml , and the linear range was 0.25 -100 ng / g .
Intra - day and day - to - day precision ( RSD ) was within 13.0 % ;
the extraction recovery rate is between 78.0 % and 84.8 % ;
The matrix effect was between 91.0 % and 101.5 % , indicating that the matrix in plasma and brain tissue samples of mice did not affect the determination of chlorpinpran ;
In the same way , the linear range of plasma in SD rats was 0.5 -500ng / ml , the linear range of brain tissue samples ranged from 0.25 to 100 ng / ml , and the linearity was good ;
Intra - day and day - to - day precision ( RSD ) was within 11.7 % ;
the recovery rate of the two samples after extraction with ethyl acetate solution was between 77.7 % and 86.0 % ;
The matrix effect was 93 . 8 % - 101.8 % , which did not affect the assay ;
The results showed that the specific properties , linear range , precision and accuracy , recovery rate and matrix effect of Chlorbipran in Kunming mice were consistent with the analytical requirements of biological samples .
In mice , the pharmacokinetic parameters Cmax , t1 / 2 , AUC0 - t were 159.6 鹵 26.5 ng / ml , 45.9 鹵 5.7min , 4172.9 鹵 349.0 ng min / ml , respectively .
t1 / 2 was 147.3 鹵 39.3 , 69.2 鹵 47.2 , 81.1 鹵 14.0min , Cmax was 4.73 鹵 0.53 , 4.660 鹵 0.78 , 9.4 鹵 0.6 ng / g , respectively .
The pharmacokinetic parameters Cmax , t1 / 2 and AUC0 - t of the rats in SD rats were estimated to be 145.1 鹵 1.3 , 28.5 鹵 5.4 ng / ml , 175.2 鹵 45.6 , 105.6 鹵 34.9 ng / ml , respectively . The absolute bioavailability of clopidogrel ( 2 mg / kg , 4 mg / kg ) was calculated at 37.38 鹵 10.0 min and 13885.1 鹵 101.3 ng min / ml . The results showed that the absolute bioavailability of clopidogrel ( 2 mg / kg , 4 mg / kg ) was 7.1 鹵 0.8 % and 5.0 鹵 0.8 % , respectively .
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R927;R96

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本文編號(hào)：2029094