本文選題：vMIP-II + CCR1��； 參考：《暨南大學》2014年碩士論文

【摘要】：目的： 以廣譜趨化因子拮抗劑vMIP-II為研究基礎，基于vMIP-II與趨化因子家族的結(jié)構(gòu)相似性，利用生物信息學方法設計和篩選來源于vMIP-II的CCR1受體拮抗性多肽，并對其進行生物學活性研究。 方法： 運用基于結(jié)構(gòu)的多重序列比對分析和蛋白酶模擬酶切等生物信息學方法，尋找vMIP-II結(jié)合CCR1的保守區(qū)和包含保守區(qū)的多肽片段，根據(jù)理化性質(zhì)分析結(jié)果篩選合適的多肽片段進行化學合成。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將重組質(zhì)粒pcDNA4/TO-CCR1轉(zhuǎn)染HEK293細胞，構(gòu)建表達CCR1受體的HEK293/CCR1細胞系，作為多肽C18P的研究平臺。通過[35S]GTPγS結(jié)合實驗驗證CCR1的受體功能以及檢測多肽C18P激活受體的能力，趨化實驗證明多肽C18P的趨化及趨化抑制作用，鈣流實驗評價多肽C18P對受體引發(fā)的細胞信號轉(zhuǎn)導的阻斷作用，配體受體結(jié)合實驗測定多肽C18P對受體的親和力，利用ELISA和熒光定量PCR從分子水平探究多肽C18P對內(nèi)毒素（LPS）炎癥細胞模型的影響。 結(jié)果： （1）建立的HEK293/CCR1細胞系能高效表達CCR1，，而且CCR1具有正常的受體功能，MIP-1α對CCR1的EC50為5.57ng/ml。 （2）多肽C18P是利用生物信息學篩選到的來源于vMIP-II的CCR1的特異性拮抗劑，本身不具有趨化性，其抑制HCC-1、MIP-1α和RANTES引起的趨化運動的IC50分別為19.08ng/ml、21.27ng/ml和10.56ng/ml，并可基本阻斷由HCC-1、MIP-1α和RANTES引起的鈣離子內(nèi)流。 （3）配體受體實驗結(jié)果表明，多肽C18P能完全抑制125I-MIP-1α與CCR1受體結(jié)合，其IC50為14.63ng/ml。當配體濃度達到100ng/ml時，其對125I-MIP-1α結(jié)合受體的抑制率均達到80%，對配體受體結(jié)合的IC50為15.09ng/ml。[35S]GTPγS結(jié)合實驗進一步證明C18P是CCR1的拮抗劑，而非激動劑。 （4）成功建立內(nèi)毒素細胞炎癥模型。ELISA法檢測結(jié)果顯示：與LPS組相比，低劑量（1.5ng/ml）的多肽C18P和地塞米松（DM）對細胞模型TNF-α、IL-6和IL-8的蛋白分泌沒有明顯的抑制作用；而中、高劑量（5ng/ml和15ng/ml）的多肽C18P和DM均對TNF-α、IL-6和IL-8的蛋白分泌具有明顯的抑制作用。熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示：多肽C18P組（15ng/ml）和DM對照組（15ng/ml）對TNF-α、IL-6和IL-8mRNA的表達具有顯著的抑制作用。NO含量檢測結(jié)果顯示：低劑量（1.5ng/ml）的多肽C18P和DM對細胞模型NO的分泌沒有明顯的抑制作用，而中、高劑量（5ng/ml和15ng/ml）的多肽C18P和DM均對NO的分泌具有明顯的抑制作用。 結(jié)論： 本研究證明來源于vMIP-II的多肽C18P是CCR1受體的特異性拮抗劑，能抑制細胞的趨化運動和鈣離子內(nèi)流，與受體有較好的親和力并能阻礙配體激活受體G蛋白，且能抑制內(nèi)毒素炎癥細胞模型分泌炎性細胞因子，具有作為抗炎藥物的研究前景。
[Abstract]:Objective: Based on the broad-spectrum chemokine antagonist vMIP-II, based on the structural similarity between vMIP-II and chemokine family, the bioinformatics method was used to design and screen the antagonistic peptides of CCR1 receptor from vMIP-II, and to study their biological activities. Methods: Bioinformatics methods such as structure-based multiple sequence alignment analysis and protease mimic enzyme digestion were used to search for conserved regions and polypeptide fragments containing conserved regions of vMIP-II combined with CCR1. According to the results of physicochemical analysis, suitable polypeptide fragments were selected for chemical synthesis. The recombinant plasmid pcDNA4/TO-CCR1 was transfected into HEK293 cells by liposome transfection, and the HEK293/CCR1 cell line expressing CCR1 receptor was constructed, which was used as the research platform of the peptide C18P. The [35s] GTP 緯 S binding assay was used to verify the receptor function of CCR1 and to detect the ability of the peptide C18P to activate the receptor. The chemotactic experiment demonstrated the chemotaxis and chemotaxis inhibition of the peptide C18P, and the calcium flow assay evaluated the blocking effect of the peptide C18P on the receptor-induced cell signal transduction. Ligand receptor binding assay was used to determine the affinity of peptide C18P to the receptor. ELISA and fluorescence quantitative PCR were used to explore the effect of C18P on the inflammatory cell model of lipopolysaccharide (LPS). Results: (1) the established HEK293/CCR1 cell line was able to express CCR1 efficiently, and CCR1 had normal receptor function and the EC50 of CCR1 was 5.57 ng / ml for MIP-1 偽. The peptide C18P is a specific antagonist from vMIP-II CCR1 screened by bioinformatics and is not chemoattractant by itself. The inhibitory effects of IC50 on chemotaxis induced by HCC-1 and RANTES were 19.08 ng / ml and 10.56 ng / ml, respectively, and calcium influx induced by HCC-1 / MIP-1 偽 and RANTES was basically blocked. The ligand receptor assay showed that the peptide C18P could completely inhibit the binding of 125I-MIP-1 偽 to CCR1 receptor, and its IC50 was 14.63 ng / ml. When the concentration of ligand reached 100ng/ml, the inhibition rate of 125I-MIP-1 偽 -binding receptor was 80%, and the IC50 binding to ligand receptor was 15.09 ng / ml. [35s] GTP 緯 S binding assay further proved that C18P was an antagonist of CCR1, not an agonist. The results of Elisa showed that compared with LPS group, the low dose of C18P and Dexamethasone (Dexamethasone) did not inhibit the secretion of TNF- 偽, IL-6 and IL-8. Both C18P and DM at high doses of 5 ng / ml and 15 ng / ml inhibited the secretion of TNF- 偽 -IL-6 and IL-8 protein. Fluorescence quantitative PCR assay showed that the expression of TNF- 偽 -IL-6 and IL-8mRNA was significantly inhibited by the peptide C18P group (15 ng / ml) and DM control group (15 ng / ml). The results showed that the low dose peptide C18P and DM had no effect on no secretion in the cell model. The obvious inhibitory effect, However, the high dose of C18P and DM of 5ng / ml and 15ng / ml respectively inhibited the secretion of no. Conclusion: This study demonstrated that C18P, a peptide derived from vMIP-II, is a specific antagonist of CCR1 receptor, which can inhibit chemotaxis and calcium influx of cells, have good affinity with receptor and block ligand activated receptor G protein. It can inhibit the secretion of inflammatory cytokines in endotoxin inflammatory cell model, so it has the research prospect as an anti-inflammatory drug.
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R91;R96

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本文編號：1968235