本文選題：活性鹵酚 + 心肌細胞��； 參考：《山西醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景:課題組前期針對天然來源的鹵酚進行了連續(xù)的系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)優(yōu)化,已經(jīng)設(shè)計合成了二苯甲酮、二苯甲烷、苯基呋喃-2-基甲酮、苯基噻吩-2-基甲酮四種骨架類型的鹵酚化合物,通過活性的系統(tǒng)篩選,獲得了多個體外具有高活性的新型鹵酚化合物。其中,對氧化損傷的血管內(nèi)皮細胞具有高保護活性的是2,4’,5’-三羥基-5,2’-二溴二苯甲酮(LM49)、4,5-二羥基2,3-二溴二苯甲酮(LM48)和3,4-二羥基-3’-氯二苯甲酮(LM46),其EC50分別為0.4μmol/L,0.8μmol/L和5.0μmol/L。通過進一步的在體研究,表明這3個化合物都具有顯著的對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用,且藥理活性最好的的是LM49,其次是LM48和LM46。此外,初步的作用機制研究已經(jīng)證實HO-1是鹵酚保護血管內(nèi)皮細胞的關(guān)鍵蛋白。目的:明確活性鹵酚LM46、LM48和LM49對Na_2S_2O_4致H9c2心肌細胞缺氧復(fù)氧損傷的保護作用,并探討HO-1蛋白與該保護作用的相關(guān)性。方法:1.Na_2S_2O_4氧耗法建立H9c2細胞缺氧復(fù)氧模型。2.采用MTT法檢測細胞相對活力,流式細胞儀檢測ROS和凋亡,試劑盒檢測LDH,MDA,SOD,CK,明確活性鹵酚對缺氧復(fù)氧心肌細胞的保護作用。3.采用Western blot和PCR法檢測活性鹵酚對HO-1的蛋白和基因表達的影響。4.采用特異性阻斷劑Zn PP阻斷HO-1,MTT法檢測細胞活力,活性熒光定量試劑盒檢測HO-1活性,明確鹵酚化合物對心肌細胞保護作用與關(guān)鍵蛋白HO-1的相關(guān)性。5.探討活性鹵酚對HO-1的誘導(dǎo)是否依賴于新HO-1mRNA的轉(zhuǎn)錄,在加入活性鹵酚之前加入mRNA合成抑制劑actinomycin D(Act D),western檢測HO-1蛋白的表達。探討活性鹵酚對HO-1的誘導(dǎo)是否依賴于新蛋白的合成,在加入鹵酚化合物之前加入蛋白合成抑制劑cycloheximide(CHX),PCR檢測HO-1mRNA的表達。6.熒光光譜法研究鹵酚化合物和HO-1蛋白的相互作用,探討它們的相互作用是否和前面的細胞保護活性及對HO-1基因水平的誘導(dǎo)順序一致。結(jié)果:1.LM46、LM48和LM49在設(shè)定劑量2.5,5和10μmol/L范圍內(nèi)可劑量依賴性地提高細胞相對活力,降低細胞凋亡率和ROS水平,升高SOD活力,抑制LDH、CK、MDA釋放,且對心肌細胞的保護活性順序為LM49LM48LM46。2.三個鹵酚化合物均可顯著誘導(dǎo)HO-1蛋白表達及升高mRNA水平,并呈量效關(guān)系和時效關(guān)系,而且對HO-1蛋白和基因表達的誘導(dǎo)作用順序為LM49LM48LM46。3.三個鹵酚化合物均可劑量依賴性的提高心肌細胞HO-1的活性,其誘導(dǎo)順序為LM49LM48LM46;采用Zn PP阻斷后,給藥組的HO-1活性及細胞保護率均顯著降低。4.加入轉(zhuǎn)錄抑制劑Act D后,三個鹵酚化合物對HO-1蛋白表達的誘導(dǎo)均較單獨給藥顯著降低;加入蛋白合成抑制劑CHX后,三個鹵酚化合物給藥組的HO-1 mRNA水平均較單獨給藥組升高。5.三個鹵酚化合物均能使HO-1的熒光光譜猝滅,猝滅機制為靜態(tài)猝滅,結(jié)合常數(shù)相差不大。從熱力學(xué)參數(shù)判斷,LM46與HO-1間相互作用力主要為范德華力、氫鍵或質(zhì)子化等作用力;LM48和LM49與HO-1間相互作用力主要為靜電作用和疏水作用力。隨著鹵酚LM48,LM49濃度的增加,同步熒光光譜色氨酸的最大發(fā)射波長略有紅移,顯示HO-1色氨酸殘基附近的微環(huán)境疏水性降低,極性增強。結(jié)合三維光譜等高線圖,可以推斷在鹵酚化合物存在下HO-1的構(gòu)象發(fā)生了變化。結(jié)論:1.活性鹵酚對缺氧復(fù)氧損傷的心肌細胞有明確的保護作用,該保護作用與抗氧化應(yīng)激、抑制細胞凋亡相關(guān),活性順序為LM49LM48LM46。2.HO-1是活性鹵酚保護心肌細胞的關(guān)鍵蛋白,活性鹵酚可通過誘導(dǎo)HO-1的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯,升高HO-1蛋白表達,提高HO-1活性,從而發(fā)揮對心肌細胞的保護作用。3.鹵酚對HO-1蛋白的誘導(dǎo)表達依賴于HO-1基因轉(zhuǎn)錄水平的升高,鹵酚對HO-1基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控并不依賴于新蛋白的合成。4.通過熒光光譜法證實了鹵酚化合物與HO-1蛋白之間存在相互作用。
[Abstract]:The protective effects of active halophenols LM46 , LM48 and LM49 on myocardial ischemia - reperfusion injury in rats were studied . 3 . The induction of HO - 1 protein was dependent on the level of HO - 1 gene transcription , and the regulation of halophenol on HO - 1 gene transcription did not depend on the synthesis of new protein . 4 . The interaction between the halophenol compound and HO - 1 protein was confirmed by fluorescence spectrometry .
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R914;R96

【參考文獻】

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本文編號：1963062