本文選題：2型糖尿病 + 白介素-1受體拮抗劑��； 參考：《浙江大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：在世界范圍內(nèi)2型糖尿病在各類疾病中占有很大比例,它被認(rèn)為是一種自身炎癥綜合癥,它的特點(diǎn)是具有漸變性p-細(xì)胞功能紊亂和胰島素抵抗,其中p-細(xì)胞功能紊亂是影響胰島分泌胰島素不足的主要因素,而胰島素抵抗又是組織特異性炎癥的誘因,導(dǎo)致其不能滿足機(jī)體高血糖和代謝的需求。這里我們主要研究引發(fā)2型糖尿病的炎癥機(jī)制,包括能夠誘導(dǎo)炎癥,胰島素抵抗,降低胰島素分泌和β-細(xì)胞功能紊亂的機(jī)制。各種促進(jìn)炎癥發(fā)生的介質(zhì)在2型糖尿病的病理過程中扮演著重要角色,因此深入研究2型糖尿病的炎癥響應(yīng)機(jī)制可能為了解進(jìn)而更好的治療2型糖尿病提供一種新的途徑。傳統(tǒng)抗糖尿病藥物有很大的缺陷,因?yàn)槠溆卸喾N潛在的副作用,如急性低血糖、體重增加、心臟和肝臟損傷、胃并發(fā)癥、呼吸道和尿路感染等,因此希望能夠開發(fā)更好的藥物進(jìn)入臨床。2型糖尿病是一種自身炎癥綜合征,因此,許多抗炎療法能夠有效治療2型糖尿病,其中白介素1受體拮抗劑(IL-1Rα)被認(rèn)為是一種有效的抗糖尿病藥物,它是一種天然抗炎劑。盡管IL-1Rα具有廣譜抗炎和抗糖尿病活性,但由于其半衰期較短(6-8小時(shí)),導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制。考慮到研究2型糖尿病的的方法學(xué)限制,不可能直接將糖尿病患者作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,因此各種具有2型糖尿病典型特征的糖尿病動(dòng)物模型被建立,用于2型糖尿病研究的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。GK大鼠被認(rèn)為是最好的非肥胖性2型糖尿病動(dòng)物模型之一,特別是其用在關(guān)于病理生理機(jī)制研究方面。目前,GK大鼠已經(jīng)被專門用于研究各種各樣具有潛在2型糖尿病療效的化合物的研究。因此,我們對(duì)GK大鼠中與2型糖尿病相關(guān)的多種病理特征,包括涉及2型糖尿病多種發(fā)病機(jī)理作了全面的總結(jié)。GK大鼠是一種具有多種病理特點(diǎn)的動(dòng)物模型,這些特點(diǎn)多或少在糖尿病患者中普遍存在并且具有功能性。這種動(dòng)物模型被認(rèn)為是研究2型糖尿病各種病理機(jī)制的最佳模型。IL-1受體拮抗劑廣譜的抗炎作用已被用于對(duì)各種自身免疫性疾病的研究。盡管IL-1受體拮抗劑有著優(yōu)異的廣譜抗炎作用,但它的生物半衰期只有4-6小時(shí),目前改善這一問題的策略主要是：延長(zhǎng)半衰期或者延長(zhǎng)IL-1受體拮抗劑在靶標(biāo)位點(diǎn)的釋放時(shí)間。為了解決延長(zhǎng)IL-1受體拮抗劑的治療持續(xù)時(shí)間的問題,首先我們對(duì)所有已經(jīng)報(bào)到過的方法進(jìn)行了綜述。這些方法考察了IL-1受體拮抗劑的體外釋放特性,藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)以及藥效學(xué)評(píng)價(jià)。嵌段式聚醚Pluronic F127 (PF127)是一種有效運(yùn)送蛋白藥物的重要生物材料。治療蛋白被嵌入基于PF127的熱敏凝膠中后,這些蛋白藥物的熱穩(wěn)定性、生物利用度、生物相容性和療效都得到了提高。通過對(duì)那些應(yīng)用PF127作為熱敏凝膠進(jìn)行藥物緩釋的方法進(jìn)行總結(jié)后沒有發(fā)現(xiàn)已知毒副作用。我們得出的結(jié)論是,PF127對(duì)蛋白及多肽藥物有很好的緩釋作用。綜上所述,我們可以預(yù)期應(yīng)用PF127的藥物在臨床上是很有潛力。我們還比較了不同蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)策略(與蛋白融合及可生物降解聚合物結(jié)合)對(duì)IL-1受體拮抗劑生物活性的影響。為了克服IL-1Rα半衰期短的缺點(diǎn)以及研究其在實(shí)驗(yàn)性大鼠模型(GK大鼠)中治療2型糖尿病效果,我們首先比較了人類IL-IRα和大鼠IL-IRα的氨基酸序列,并且計(jì)算了它們與大鼠受體的結(jié)合情況。這項(xiàng)研究的目的是了解人類IL-IRα和大鼠IL-IRα的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和配體之間連接相似性的關(guān)系。我們利用分子模擬技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)測(cè)定、序列對(duì)比、結(jié)構(gòu)修飾以及和相關(guān)蛋白的對(duì)接。最后,我們還利用AutoDock程序?qū)Υ笫笫荏w(IL-1RI)的配體之間進(jìn)行了對(duì)接。結(jié)果顯示,人類IL-1Rα和大鼠IL-1Rα序列和結(jié)構(gòu)的相似性和統(tǒng)一性分別是85.4%和73.6%。從蛋白對(duì)接的結(jié)果中,我們發(fā)現(xiàn)三個(gè)受體中有兩個(gè),即LYS290和ASP259在大鼠受體IL-1RI兩種配體的結(jié)合中是一樣的。兩種配體結(jié)合位點(diǎn)明顯的相似性說明兩種配體可能擁有相同的治療效果。以上研究還排除了一個(gè)物種的IL-1Ra用于另一物種時(shí)可能出現(xiàn)的不確定因素。當(dāng)我們成功發(fā)現(xiàn)人類IL-IRα與大鼠IL-IRα相似性以后,我們利用GK大鼠進(jìn)一步研究IL-IRα對(duì)2型糖尿病的治療效果。我們給GK大鼠皮下注射IL-IRα (10mg/kg、每天兩次)一個(gè)月。同時(shí),我們也給GK大鼠和Wistar大鼠注射生理鹽水一個(gè)月,從而比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的差別。在治療期間,我們持續(xù)監(jiān)控每組大鼠的體重和食物攝取量,同時(shí)每周對(duì)大鼠進(jìn)行2-3次血糖水平測(cè)定。在治療結(jié)束前,我們分別對(duì)大鼠進(jìn)行絕食8小時(shí)測(cè)定其ITT以及絕食過夜后測(cè)定IPGTT。胰島素抵抗和β-細(xì)胞的功能利用HOMA和QUICKI模型和做ITT和IPGTT之前測(cè)定的空腹胰島素和葡萄糖水平計(jì)算。IL-IRα在GK大鼠治療期間沒有影響大鼠的體重和/或食物攝入量。整個(gè)治療期間,每組中GK大鼠的體重都持續(xù)增加,同時(shí)每組GK大鼠的平均進(jìn)食量也持續(xù)增加,我們并未發(fā)現(xiàn)給藥組的GK大鼠和對(duì)照組的Wistar大鼠和GK大鼠有任何顯著差異。在治療之前,GK大鼠(兩組)和Wistar大鼠的血糖含量有顯著差異。在利用IL-IRα以及生理鹽水治療的初期,對(duì)GK大鼠連續(xù)12天注射IL-1Ra,給藥組和對(duì)照組的血糖含量沒有明顯差異,提示IL-IRα并未顯著改善其血糖水平。同時(shí),GK大鼠(兩組)和Wistar大鼠之間的血糖含量仍然存在顯著差異。后來,由于持續(xù)注射IL-IRα,12天以后,GK大鼠給藥組的血糖含量開始下降,在治療后期GK大鼠給藥組和對(duì)照組的血糖含量出現(xiàn)顯著差異。同時(shí)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組GK大鼠和Wistar大鼠的血糖含量沒有顯著差異,而GK大鼠對(duì)照組的血糖含量明顯高于Wistar大鼠對(duì)照組的血糖含量。ITT和IPGTT結(jié)果表明對(duì)GK大鼠持續(xù)注射IL-IRα明顯改善了其胰島素敏感性和葡萄糖耐量,這表明IL-IRα具有改善胰島素敏感性和保護(hù)β-細(xì)胞的功能。此外,在治療后期,我們考察了多種代謝物在血清中的水平,血清中胰島素原、胰島素和胰島素原/胰島素比率在GK大鼠實(shí)驗(yàn)組中顯著降低,同時(shí)IL-1Rα在GK大鼠實(shí)驗(yàn)組中也展現(xiàn)了其對(duì)各種血脂水平和腎功能生物標(biāo)志物的顯著療效。免疫組織化學(xué)分析顯示,與對(duì)照組相比,在經(jīng)過IL-1Ra治療的GK大鼠中,胰島細(xì)胞中只存在最少量的吞噬細(xì)胞,這表明胰島內(nèi)炎癥的減少。我們研究的結(jié)果表明IL-1Rα在GK大鼠中具有廣譜治療潛力,因?yàn)樗ㄟ^改善糖耐量和胰島素敏感性從而顯著降低IL-1β與IL-1依賴的促炎介質(zhì)的不良反應(yīng)。但由于較短的生物半衰期(6-8小時(shí))而需要高劑量、頻繁給藥。因此,有必要開發(fā)一種緩釋制劑延長(zhǎng)它的半衰期。為了應(yīng)對(duì)IL-1Ra生物半衰期短的問題,到目前為止,已經(jīng)建立了許多策略延長(zhǎng)其半衰期和延長(zhǎng)IL-1Ra從其靶點(diǎn)的穩(wěn)定持續(xù)釋放。所有的方法要么通過融合蛋白技術(shù)將IL-1Ra與其他蛋白融合以延長(zhǎng)其半衰期,要么通過使用各種生物降解聚合物開發(fā)新的劑型以延長(zhǎng)其在靶點(diǎn)的穩(wěn)定持續(xù)釋放時(shí)間。這些方法已經(jīng)進(jìn)行了體外釋放特征和IL-1Ra的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)參數(shù)的考察。但是這些方法都未曾在糖尿病動(dòng)物模型中去考察其對(duì)2型糖尿病的效果。除此之外,這些方法也存在一些局限性。在本研究中,我們利用生物降解聚合物PF127用于IL-1Ra的緩釋。PF127曾被報(bào)道能延長(zhǎng)多種蛋白藥物的緩釋過程及其血清半衰期。因此,我們延伸此法用以克服IL-1Ra生物半衰期短的問題,我們第一次利用基于PF127的熱敏凝膠制成了1L-1Ra的新劑型,并研究其在體內(nèi)和體外延長(zhǎng)半衰期的效果。我們利用冷法準(zhǔn)備了三種濃度(20%,25%和30%)的PF127凝膠,考察了多種流變性特征(GT和粘度)并利用非膜溶解法進(jìn)行體外藥物釋放動(dòng)力學(xué)研究。我們用SDS-PAGE分析了載IL-1Ra PF127凝膠劑型的體外穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上,我們還利用20%和25%的PF127凝膠在wistar大鼠上進(jìn)行體內(nèi)研究以及25%的載藥PF127進(jìn)行IL-1Ra生物活性的體內(nèi)研究。從結(jié)果中,我們發(fā)現(xiàn)GT和PF127的濃度呈反相關(guān),而粘度和PF127的濃度呈正相關(guān)。IL-1Ra從PF127凝膠中的體外釋放模式遵循零級(jí)釋放動(dòng)力模型。我們還用AIC計(jì)算釋放動(dòng)力模型的R2值,進(jìn)而預(yù)測(cè)IL-1Ra體外釋放的最佳擬合模型,零級(jí)釋放動(dòng)力模型因其與其它模型相比具有最低的R2值而被認(rèn)為是最佳擬合模型。根據(jù)Korsmeyer-Peppas方程,IL-1Ra從PF127凝膠中的釋放機(jī)理取決于PF127凝膠的侵蝕性和濃度。SDS-PAGE證明了在體外釋放時(shí)的IL-1IRa急定性。當(dāng)與IL-1Ra水溶液直接相比時(shí),載藥PF127凝膠在體內(nèi)和體外釋放IL-1Ra的時(shí)間延長(zhǎng),同時(shí)對(duì)降低血糖和抑制IL-6的IL-1β刺激產(chǎn)物也表現(xiàn)出更好的效果。IL-1Ra在體內(nèi)的吸收和IL-1Ra在25%和PF127凝膠中的釋放相關(guān)性良好,其相關(guān)系數(shù)達(dá)到R2=0.9952.我們進(jìn)一步研究了在在不同溫度(4。C、25。C和40℃)下儲(chǔ)存三個(gè)月的PF127凝膠劑型中IL-1Ra的穩(wěn)定性。定期采集樣本用于研究其體外藥物釋放動(dòng)力學(xué)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在整個(gè)過程中,4℃條件下PF127凝膠劑型中IL-1Ra的GT、粘度和體外釋放模式保持相同。差示掃描量熱儀(DSC)的結(jié)果顯示PF127凝膠劑型可以提高其中IL-1Ra的熱穩(wěn)定性。在整個(gè)FTIR光譜中IL-1Ra沒有明顯變化,表明在IL-1Ra結(jié)構(gòu)中沒有聚合物效應(yīng)。此外FTIR的結(jié)果也表明在整個(gè)研究期間沒有藥物-聚合物相互作用,而SDS-PAGE結(jié)果證明了在PF127中IL-1Ra的穩(wěn)定性。這些結(jié)果為下面的結(jié)論提供了證據(jù)：PF127是一種理想的聚合物,不僅有利于IL-1Ra的持續(xù)性運(yùn)輸,而且在延長(zhǎng)半衰期的同時(shí)保持了其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。隨后,我們進(jìn)一步利用GK大鼠研究25%的PF127中IL-1Ra的長(zhǎng)期抗糖尿病效果。我們給GK大鼠皮下注射載IL-1Ra的25%PF127凝膠劑型(10mg/kg/天)一個(gè)月,同時(shí)在Wistar大鼠和GK大鼠中注射正理鹽水一個(gè)月進(jìn)行對(duì)照。在治療期間,每周對(duì)大鼠進(jìn)行2-3次體重監(jiān)測(cè)和血糖含量測(cè)定。在治療結(jié)束之前,對(duì)大鼠進(jìn)行空腹過夜后測(cè)定其IPGTT。我們還利用HOMA-IR, HOMA-β, FIGR和QUICKI模型和空腹胰島素和葡萄糖水平計(jì)算了胰島素抵抗、胰島素敏感和β-細(xì)胞的分泌功能。載IL-IRα的25%PF127凝膠劑型在GK大鼠實(shí)驗(yàn)組中表現(xiàn)出持續(xù)性、長(zhǎng)期性的降血糖效應(yīng)并且在治療期間對(duì)GK大鼠的體重沒有影響。治療之前,Wistar大鼠和GK大鼠(兩組)的血糖含量有明顯區(qū)別。給藥后的前15天,GK大鼠實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的血糖含量沒有明顯差異,說明此時(shí)載IL-1Rα的25%PF127凝膠劑型沒有改變GK大鼠的血糖含量,而Wistar大鼠和GK大鼠(兩組)的血糖含量仍然明顯區(qū)別。繼續(xù)進(jìn)行給藥治療后,GK大鼠實(shí)驗(yàn)組的血糖含量從治療的第15天開始下降并且在治療結(jié)束時(shí)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的血糖含量有明顯差異。同時(shí)在治療后期,我們也發(fā)現(xiàn)GK大鼠實(shí)驗(yàn)組和Wistar大鼠的血糖含量沒有顯著差異,而GK大鼠對(duì)照組的血糖含量明顯高于Wistar大鼠對(duì)照組的血糖含量。IPGTT結(jié)果表明載IL-1Ra的25%PF127凝膠劑在被治療的動(dòng)物中能增加其葡萄糖耐受量,同時(shí)增加胰島素敏感性和β-細(xì)胞的分泌功能。GK大鼠實(shí)驗(yàn)組和Wistar大鼠在給予葡萄糖刺激后分泌的胰島素含量明顯高于GK大鼠對(duì)照組�；诳崭寡呛鸵葝u素水平,我們還利用多種模型估計(jì)了胰島素抵抗、胰島素敏感和β-細(xì)胞分泌功能。HOMA-IR, HOMA-β, FIGR和QUICKI模型的結(jié)果顯示,載IL-1Ra的25%PF127凝膠劑型降低了胰島素抵抗和β-細(xì)胞分泌功能。此外,在治療后期,我們考察了多種代謝物的血清水平,血清中胰島素原、胰島素和胰島素原/胰島素比率在GK大鼠實(shí)驗(yàn)組中顯著降低,同時(shí)IL-1Ra在GK大鼠實(shí)驗(yàn)組中也展現(xiàn)了其對(duì)各種血脂水平和腎功能生物標(biāo)志物的顯著療效。與生理鹽水治療的GK大鼠相比,用載IL-1Ra的25%PF127凝膠劑治療后,免疫組織化學(xué)分析顯示胰島細(xì)胞中只含有微量的巨噬細(xì)胞。同時(shí),在被治療的動(dòng)物的皮膚和腎臟中沒有發(fā)現(xiàn)PF-127誘導(dǎo)的病理性變化。因此,我們得出結(jié)論：載IL-1Ra的PF127凝膠劑在GK大鼠中具有緩解2型糖尿病癥狀的廣譜抗炎作用。我們相信將IL-1Ra制成PF127緩釋劑型有可能成為最佳劑型之一,達(dá)到臨床治療所需的效果而不需要大劑量、頻繁給藥。我們的研究對(duì)安全有效的利用生物降解聚合物PF127持續(xù)性釋放IL-1Ra以及其在GK大鼠中皮下注射1個(gè)月的應(yīng)用提供了進(jìn)一步的了解。因此,利用PF127進(jìn)行藥物的持續(xù)性釋放是解決IL-1Ra生物半衰期短的一種途徑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：1957502