本文選題：己烯雌酚 + 生殖毒性��； 參考：《蘭州大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：研究背景 近年來隨著獸藥、農(nóng)藥、激素和飼料添加劑等的廣泛應(yīng)用,我國畜牧業(yè)迅猛發(fā)展、畜產(chǎn)品數(shù)量高速增長,但同時也給畜產(chǎn)品的安全帶來了巨大隱患。己烯雌酚(diethylstilbestrol, DES)是一種非甾體類雌激素,它是由人工進(jìn)行合成的。它目前常用于家畜禽的增肉劑,魚類生長促進(jìn)劑等。該化合物在生物體內(nèi)不易降解,通過食物鏈富集,并最終作用于人體。它在結(jié)構(gòu)和功能上與內(nèi)源性雌激素(如雌二醇)極其相似,可干擾機體的內(nèi)分泌物質(zhì)的正常功能,破壞機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,進(jìn)而影響機體的生殖系統(tǒng)發(fā)育,導(dǎo)致生殖障礙,甚至引發(fā)腫瘤。大量流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示近年來男性精子數(shù)量減少、精子質(zhì)量下降、睪丸癌和前列腺癌的發(fā)病率明顯上升、男性女性化等可能與人們長期暴露于這些環(huán)境雌激素污染物中有一定關(guān)系。因此,環(huán)境雌激素對雄(男)性生殖系統(tǒng)的危害已成為目前研究的熱點之一。 本課題選取食品添加劑中常見的雌激素污染物——己烯雌酚作為研究對象。一方面,建立己烯雌酚對小鼠精母細(xì)胞(GC-2)的染毒模型,并對其損傷效應(yīng)進(jìn)行全面評價。另一方面,從DNA甲基化的角度入手,深入探討己烯雌酚生殖毒性過程中發(fā)生DNA甲基化修飾異常的基因,并以該基因作為線索來進(jìn)一步闡明己烯雌酚生殖毒性的分子生物學(xué)機制。 第一章己烯雌酚對小鼠精母細(xì)胞染毒模型的建立及損傷效應(yīng)評價 目的： 通過建立DES對GC-2細(xì)胞的體外染毒模型,觀察細(xì)胞形態(tài),檢測活性氧、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等細(xì)胞功能學(xué)指標(biāo),從而對己烯雌酚生殖毒性的損傷效應(yīng)進(jìn)行初步評價。 方法： 1.細(xì)胞活力檢測：GC-2細(xì)胞分別用不同濃度DES (0-100μM)作用24h、48h和72h,使用細(xì)胞增殖—毒性檢測試劑盒(CCK8)檢測細(xì)胞活力。 2.細(xì)胞形態(tài)觀察：GC-2細(xì)胞分別用DMSO,0.2、2、20μM DES作用48h,在光學(xué)倒置顯微鏡(10×)下觀察拍照。 3.細(xì)胞周期檢測：GC-2細(xì)胞分別用DMSO,0.2、2、20μM DES作用48h,使用細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期檢測試劑盒處理各組細(xì)胞后,在流式細(xì)胞儀相應(yīng)的程序下進(jìn)行檢測。 4.細(xì)胞增殖檢測：GC-2細(xì)胞分別用DMSO,0.2、2、20μM DES作用48h,使用EdU試劑盒處理各組細(xì)胞后,在熒光倒置顯微鏡UV和Green光激發(fā)下進(jìn)行觀察拍照。 5.ROS檢測：GC-2細(xì)胞分別用DMSO,0.2、2、20μM DES作用48h,使用細(xì)胞活性氧檢測試劑盒處理各組細(xì)胞后,在流式細(xì)胞儀下檢測細(xì)胞ROS變化情況。 6細(xì)胞凋亡檢測：GC-2細(xì)胞分別用DMSO,0.2、2、20μM DES作用48h,采用Hoechst33258染色后,在熒光倒置顯微鏡UV光激發(fā)下進(jìn)行觀察拍照；GC-2細(xì)胞分別用DMSO,0.2、2、20μM DES作用48h,采用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒處理各組細(xì)胞后,在流式細(xì)胞儀相應(yīng)的程序下測定GC-2的凋亡率；GC-2細(xì)胞分別用DMSO,0.2、2、20μM DES作用48h,采用WesternBlot檢測凋亡蛋白(如：Bax、Bc12、Caspase3、Caspase9)的變化情況。 結(jié)果： 1.GC-2細(xì)胞隨著DES作用時間和濃度的增加,其細(xì)胞活力逐漸下降,表現(xiàn)出一定的時間-劑量依賴性。 2.與DMSO陰性對照組相比,隨著DES濃度的增加,GC-2細(xì)胞形態(tài)發(fā)生多樣性改變,細(xì)胞密度也明顯減少。 3.與DMSO陰性對照組相比,隨著DES藥物濃度的增加,S期細(xì)胞所占百分比明顯增加(P＜0.01),G2/M期所占百分比明顯減少(P＜0.01)。表明DES可阻滯GC-2于S期,抑制GC-2的增殖。 4.與DMSO陰性對照組相比,隨著DES藥物濃度的增加,新生GC-2細(xì)胞所占比率明顯減少(P0.01)。表明DES能明顯抑制GC-2細(xì)胞的新生。 5.與DMSO陰性對照組相比,20μM DES的染毒組DCFH-DA的平均熒光強度明顯增高(P0.01)。表明DES能夠誘導(dǎo)GC-2細(xì)胞內(nèi)ROS含量升高。 6.與DMSO陰性對照組相比,經(jīng)Hoechst33258染色后,隨著DES藥物濃度的增加,GC-2細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞核聚集,染色明顯增強,并有細(xì)胞核碎片,可見凋亡小體。采用Annexin V/PI雙染檢測結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡比率明顯增高(P0.01)。采用Western Blot從蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn)凋亡蛋白也發(fā)生不同程度的改變。表明DES能夠促進(jìn)GC-2細(xì)胞發(fā)生凋亡。 結(jié)論： 己烯雌酚作用于小鼠精母細(xì)胞后,會引起其細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變,ROS含量明顯增高,使其阻滯于S期,增殖被抑制,凋亡發(fā)生,表明DES具有明顯的生殖毒性。 第二章DNA甲基化在己烯雌酚生殖毒性中的作用研究 目的： 利用.已建立的DES作用于GC-2細(xì)胞的染毒模型,探討該染毒模型中是否存在DNA總甲基化水平及DNMTs表達(dá)水平的異常,并通過芯片結(jié)果篩選出DNA甲基化修飾異常的基因。 方法： 1.采用5-mC點雜交法對細(xì)胞染毒模型的DNA總甲基化水平進(jìn)行檢測。 2.采用real-time PCR和Western Blot對細(xì)胞染毒模型的DNMTs mRNA和蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行檢測。 3.采用DNA甲基化芯片技術(shù)分別獲得20μM DES染毒組和對照組的芯片結(jié)果,并對兩組結(jié)果進(jìn)行比較,篩選出染毒模型中存在DNA甲基化修飾異常的基因。 4.采用MSP對存在DNA甲基化修飾異常的部分基因進(jìn)行驗證。 5.對Rxra基因的MSP產(chǎn)物,測序,并進(jìn)一步驗證。 6.采用real-time PCR對20μM DES染毒組和對照組中Rxra基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測。 結(jié)果： 1.與DMSO陰性對照組相比,隨著DES濃度的增高,DNA總甲基化水平顯著降低(P0.01)。 2.與DMSO陰性對照組相比,隨著DES濃度的增高,DNMT1的mRNA水平的表達(dá)顯著增高(P＜0.01), DNMT3a和DNMT3b的mRNA水平的表達(dá)顯著降低(P0.01)。 與DMSO陰性對照組相比,隨著DES濃度的增高,DNMT1和DNMT3b蛋白水平的表達(dá)顯著降低(P＜0.01); DNMT3a蛋白水平的表達(dá)顯著增高(P0.01)。 3.通過比較20μM DES染毒組和對照組的DNA甲基化譜,獲得該染毒模型中DNA甲基化修飾異常的基因,其中甲基化程度上調(diào)3倍以上的基因有66個,甲基化程度下調(diào)3倍以上的基因有6個。上述差異基因與細(xì)胞的生長、分化、周期、凋亡和氧化應(yīng)激等生物學(xué)過程有關(guān)。 4.驗證該染毒模型中DNA甲基化修飾異常的部分基因,結(jié)果顯示相比于對照組,Rxra基因在20μM DES染毒模型組發(fā)生明顯高甲基化,與基因芯片結(jié)果相一致。 5.通過對Rxra基因的MSP產(chǎn)物進(jìn)行測序,并對測序結(jié)果進(jìn)行分析,結(jié)果顯示相比于對照組,Rxra基因在20μM DES染毒組發(fā)生高甲基化。 6.與對照組相比,20μM DES染毒組中Rxra基因的mRNA水平明顯降低(P0.01)。 結(jié)論： 在DES作用于GC-2細(xì)胞的染毒模型中,DNA總甲基化水平降低,DNMT1、 DNMT3a及DNMT3b的mRNA和蛋白水平也發(fā)生不同程度的改變,表明在該染毒模型中確實發(fā)生異常的DNA甲基化修飾。通過比較20μM DES染毒組和對照組的DNA甲基化譜,獲得該染毒模型中DNA甲基化修飾異常的基因,驗證發(fā)現(xiàn)相比于對照組,Rxra在20μM DES染毒組中發(fā)生高甲基化,同時nRNA水平低表達(dá),這為后續(xù)進(jìn)一步深入研究己烯雌酚生殖毒性提供了線索。
[Abstract]:Research background
In recent years, with the extensive application of veterinary drugs, pesticides, hormones and feed additives, the rapid development of animal husbandry in China, the rapid growth of livestock products, but also the safety of livestock products has brought huge hidden dangers. Diethylstilbestrol (diethylstilbestrol, DES) is a non steroid estrogen, it is synthesized artificially. It is currently used in common use. This compound is not easy to degrade in living animals, and is not easy to degrade in the organism. It is enriched by the food chain and ultimately acts on the human body. It is very similar in structure and function to endogenous estrogen, such as estradiol, which can interfere with the normal function of the body's endocrine substances and destroy the stability of the environment in the body of the machine, and then shadow the body. A large number of epidemiological investigations show that the number of male sperm has decreased, the quality of sperm has declined in recent years, the incidence of testicular and prostate cancer has increased significantly, and male feminization may be associated with the exposure of people to these environmental estrogen pollutants for a long period of time. Therefore, the harm of environmental estrogens to male reproductive system has become one of the hotspots in current research.
On the one hand, we establish diethylstilbestrol (diethylstilbestrol) to mouse spermatocyte (GC-2) and evaluate its damage effect in a comprehensive way. On the other hand, from the point of view of DNA methylation, the reproductive toxicity process of diethylstilbestrol is deeply discussed. The abnormal gene of DNA methylation was detected and the molecular mechanism of diethylstilbestrol reproductive toxicity was further elucidated by using the gene as a clue.
Chapter 1 Establishment of a mouse model of exposure to diethylstilbestrol and evaluation of its damage effect
Objective:
The damage effect of diethylstilbestrol on the reproductive toxicity of diethylstilbestrol was preliminarily evaluated by establishing the in vitro model of DES on GC-2 cells, observing cell morphology, detecting active oxygen, cell cycle, cell proliferation and cell apoptosis.
Method錛，

本文編號：1956468