本文選題：鵝膏菌 + 鵝膏肽類毒素�。� 參考：《錦州醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的毒蘑菇中毒死亡人數(shù)占整個(gè)食物中毒死亡人數(shù)的比例達(dá)到35.57%[1],其中90%以上的死亡事件是由鵝膏菌屬(Amanita)引起的,鵝膏菌的致死原因是其含有鵝膏肽類毒素。鵝膏肽類毒素不僅具有高毒性,也廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)與基因工程等領(lǐng)域,具有重要的價(jià)值。但目前鵝膏肽類毒素只能從鵝膏菌中提取,尚不能人工合成,造成國(guó)內(nèi)絕大多數(shù)鵝膏肽類毒素的標(biāo)準(zhǔn)品至今仍無法獲得,其中毒傘肽更是少見。假淡紅鵝膏菌(A.subpallidorosea)是我們課題組近年來新發(fā)現(xiàn)的一種劇毒鵝膏,其含有的鵝膏肽類毒素不僅種類多且含量高,因此我們以假淡紅鵝膏為研究對(duì)象,建立準(zhǔn)確可靠的分析與制備方法對(duì)其所含的毒素進(jìn)行分離與鑒定。其次,我國(guó)主要?jiǎng)《均Z膏主要有灰花紋鵝膏(A.fuliginea)、致命鵝膏(A.exitialis)、裂皮鵝膏(A.rimosa)等。其外觀相似,往往難以區(qū)分,常造成誤食而引起中毒死亡。文獻(xiàn)報(bào)道鵝膏菌種間毒素成分及含量存在差異。因此我們收集國(guó)內(nèi)外12種常見的劇毒鵝膏菌,建立液相色譜指紋圖譜,對(duì)12種鵝膏菌所含的鵝膏肽類毒素成分及含量進(jìn)行差異性比較研究。此外,由DNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明假淡紅鵝膏與鱗柄白鵝膏(A.virosa)聚在一個(gè)分支上,從基因水平上表明他們具有親緣關(guān)系,毒素分析也表明兩者都含有同一種毒傘肽(Virotoxins)即二羥毒傘肽(Viroidin),而目前國(guó)際上較少有人對(duì)假淡紅鵝膏和鱗柄白鵝膏的毒素成分進(jìn)行系統(tǒng)性的比較分析。因此我們采集不同產(chǎn)地的假淡紅鵝膏與鱗柄白鵝膏,建立液相色譜指紋圖譜,比較分析兩種鵝膏菌以及不同采集地的同種鵝膏菌間的同一性與多樣性。另外,鵝膏菌中毒后存在假愈期,常造成誤診。因此,在鵝膏菌中毒的救治中,早期正確診斷對(duì)病人的成功救治十分重要,這就需要建立人體生物樣本中鵝膏肽類毒素的快速確證及定量分析方法。因此本研究建立了α-鵝膏毒肽(α-Amanitin,α-AMA)、β-鵝膏毒肽(β-Amanitin,β-AMA)、二羥鬼筆環(huán)肽(Phalloidin,PHD)、丙氨酸羥毒傘肽(Ala-viroidin)以及二羥毒傘肽在人體血漿與尿液中的快速毒素確證及定量方法。方法隨著液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)的不斷發(fā)展,LC-MS/MS已成為分析該類毒素的重要方法,其所需樣品量少、靈敏度高以及速度快等。本文采用高效液相色譜(HPLC)與高分辨質(zhì)譜聯(lián)用法(HRMS)分離、鑒定假淡紅鵝膏菌中的毒素成分,并對(duì)其中的鵝膏肽類毒素進(jìn)行純化。樣品經(jīng)含0.5%甲酸的50%甲醇水溶液提取后,采用Agilent 300Extend-C18色譜柱,含0.05%三氟乙酸(TFA)的乙酸銨(20 mmol/L)水溶液-甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫分離。進(jìn)一步對(duì)12種劇毒鵝膏菌以及不同產(chǎn)地的鱗柄白鵝膏、假淡紅鵝膏中毒素成分及含量差異進(jìn)行了比較分析本文采用LC-MS/MS對(duì)人體血漿、尿液中α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、二羥鬼筆環(huán)肽、丙氨酸羥毒傘肽、二羥毒傘肽進(jìn)行同時(shí)測(cè)定;采用固相萃取技術(shù),建立了高通量、快速、簡(jiǎn)單且回收率高的樣品凈化方法。結(jié)果假淡紅鵝膏的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:假淡紅鵝膏中共檢出12種組分,經(jīng)鑒定9種為已知鵝膏肽類毒素,其中4種為鵝膏毒肽(Amatoxins),2種為鬼筆環(huán)肽(Phallotoxins),3種為毒傘肽;另外也檢出3種未知新組分,其中1種為二羥鬼筆環(huán)肽同分異構(gòu)體,2種推斷為新的環(huán)七肽毒素。值得一提的是,在假淡紅鵝膏菌中同時(shí)檢出丙氨酸羥毒傘肽、二羥毒傘肽和三羥毒傘肽(Viroisin)3種毒傘肽,實(shí)屬罕見。同時(shí),采用制備液相色譜純化了9種毫克級(jí)鵝膏肽類毒素,純度均在95%以上。可見,本研究為鵝膏肽類毒素的開發(fā)利用提供了新的資源以及為突發(fā)性毒蘑菇中毒事件的快速診斷提供了有效的技術(shù)支持。通過12種鵝膏菌的高效液相色譜圖比較可知,鵝膏菌種間的毒素成分及相對(duì)含量差異較大,呈現(xiàn)顯著的色譜指紋特征信息,其中共檢出19種化合物,13種屬于已知鵝膏肽類毒素,1種為二羥鬼筆環(huán)肽的同分異構(gòu)體,并且在多數(shù)鵝膏菌中均檢出該毒素。4種為未知鵝膏肽類新毒素,1種為未知小分子化合物組分,不屬于肽類毒素,且菌種不同鵝膏肽類毒素成分及種類差異明顯,這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。另外,假淡紅鵝膏與鱗柄白鵝膏的研究結(jié)果表明,不同產(chǎn)地的假淡紅鵝膏毒素種類均多于鱗柄白鵝膏,α-鵝膏毒肽的含量均高于鱗柄白鵝膏,且不同產(chǎn)地的鱗柄白鵝膏均不含β-鵝膏毒肽。其次,產(chǎn)地不同,鱗柄白鵝膏的毒素成分與含量均存在明顯差異,而假淡紅鵝膏的毒素成分無明顯差異,但含量則不同。進(jìn)一步,本文建立了生物樣本中包括毒傘肽在內(nèi)的5種鵝膏肽類毒素快速確證及定量方法,該方法的靈敏度高且準(zhǔn)確度、精密度、回收率及基質(zhì)效應(yīng)等均符合方法學(xué)驗(yàn)證要求。為臨床上突發(fā)性蘑菇中毒的應(yīng)急檢測(cè)提供了技術(shù)支持。本研究對(duì)正確識(shí)別鵝膏菌的種類,預(yù)防和鑒別鵝膏毒肽中毒事件以及臨床診斷及治療提供了有效的科學(xué)依據(jù)。結(jié)論本研究建立了鵝膏菌中毒素分析、制備及鑒定的方法,完成了9種主要鵝膏肽類毒素參考品的制備,純度均在95%以上,并發(fā)現(xiàn)2種新毒素;同時(shí),證明假淡紅鵝膏是目前含有鵝膏肽類毒素成分最多且含量最高的新菌種。進(jìn)一步,建立了多種劇毒鵝膏菌的指紋圖譜,完成了毒素成分及含量的測(cè)定,能夠?qū)崿F(xiàn)劇毒鵝膏菌種間毒素成分及含量的同一性與多樣性的比較;能夠?qū)崿F(xiàn)鵝膏菌種間的分類識(shí)別。另外,建立了簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、回收率高以及可同時(shí)定量分析生物樣本中多種鵝膏肽類毒素的LC-MS/MS方法。
[Abstract]:In this paper , we collected 12 species of Amanita , a kind of poisonous goose paste , which can be used widely in the fields of medicine and genetic engineering . In this paper , we have made a comparative analysis of the components and contents of toxin in human plasma and urine by HPLC - MS / MS . The results show that there are 19 compounds , 13 species belong to known goose paste peptides , 1 is the unknown small molecule compound component , 1 is the unknown small molecule compound component , 1 is the unknown small molecule compound component , 1 is the unknown small molecule compound component , and it is not belong to the peptide type toxin .
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R99

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本文編號(hào)：1955734