本文選題：膿毒癥 + 內(nèi)毒素　； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的:膿毒癥(sepsis)是臨床上嚴(yán)重感染患者常見(jiàn)的致命性并發(fā)癥,發(fā)病率和病死率一直居高不下,迄今為止除了抗感染和抗休克等對(duì)癥治療措施以外,仍然沒(méi)有理想的特效治療手段。因此,臨床上對(duì)于抗膿毒癥藥物存在巨大需求�，F(xiàn)有研究已經(jīng)證實(shí),膿毒癥是由于侵入人體的病原體釋放的病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)被體內(nèi)相應(yīng)的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs)結(jié)合與識(shí)別,引發(fā)全身性的過(guò)度炎癥反應(yīng)。統(tǒng)計(jì)顯示,在發(fā)生膿毒癥的患者體內(nèi),90%以上的病原體為細(xì)菌,而細(xì)菌產(chǎn)生的PAMPs中毒性強(qiáng)、數(shù)量多、分布廣的PAMPs主要是內(nèi)毒素/脂多糖(endotoxin/lipopolysaccharide,LPS),細(xì)菌基因組DNA(細(xì)菌非甲基化Cp G DNA)以及肽聚糖(peptidoglycan,PGN)等。因此,以細(xì)菌產(chǎn)生的主要PAMPs為靶標(biāo)拮抗膿毒癥是一條可行的治療策略。在這一策略指導(dǎo)下,我們利用生物傳感器定向垂釣技術(shù),從中藥中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)具有同時(shí)拮抗LPS和Cp G DNA活性的先導(dǎo)化合物苦柯胺B(kukoamine B,KB)。KB能夠結(jié)合并中和LPS和Cp G DNA,阻斷它們與各自受體的結(jié)合,從而抑制炎癥反應(yīng),改善膿毒癥模型動(dòng)物各項(xiàng)生理指標(biāo),提高生存率。盡管KB的藥理活性與作用機(jī)制已經(jīng)得到證實(shí),但其為何能同時(shí)作用于兩種靶標(biāo)尚不清楚。本課題擬通過(guò)分子相互作用的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)分析以及分子對(duì)接等手段揭示KB與LPS和Cp G DNA的結(jié)合模式,闡明其結(jié)合作用機(jī)理,據(jù)此設(shè)計(jì)一系列衍生物,并進(jìn)行生物學(xué)活性評(píng)價(jià),以期發(fā)現(xiàn)具有更強(qiáng)活性的化合物,為開(kāi)發(fā)更好的抗膿毒癥藥物奠定基礎(chǔ)。方法:1.采用共振鏡生物傳感器,將LPS的活性中心lipid A包被于芯片表面,檢測(cè)KB與lipid A的結(jié)合作用;采用雙偏振極化干涉儀(dual polarization interferometry,DPI),將Cp G DNA包被于芯片表面,檢測(cè)KB與Cp G DNA的結(jié)合作用;采用等溫滴定量熱儀(isothermal titration calorimetry,ITC),分別檢測(cè)KB與LPS和Cp G DNA的結(jié)合作用;采用分子對(duì)接,分別分析KB與LPS和Cp G DNA的結(jié)合模式。從分子結(jié)合動(dòng)力學(xué)、熱力學(xué)以及計(jì)算機(jī)模擬等不同角度分析KB與LPS和Cp G DNA的結(jié)合作用;2.根據(jù)KB與LPS和Cp G DNA相互作用的結(jié)構(gòu)特征和模式,設(shè)計(jì)一系列KB衍生物,并采用基于分子對(duì)接和藥效團(tuán)搜索的方法進(jìn)行首輪虛擬篩選,從中遴選出活性預(yù)測(cè)較好的化合物進(jìn)行合成;3.通過(guò)共振鏡生物傳感器檢測(cè)KB衍生物與LPS和Cp G DNA的結(jié)合作用;動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑檢測(cè)KB衍生物(0.1和1μM)對(duì)LPS(5 ng/ml)引發(fā)鱟試劑凝集反應(yīng)的抑制作用;酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)KB衍生物(0.3和1μM)對(duì)LPS(100 ng/ml)和Cp G DNA(10μg/ml)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放細(xì)胞因子TNF-α的抑制作用。通過(guò)生物活性評(píng)價(jià)對(duì)合成的KB衍生物進(jìn)行進(jìn)一步的篩選,從中選擇活性最好的化合物進(jìn)行體內(nèi)外活性評(píng)價(jià);4.對(duì)最終篩選出的KB衍生物H1,采用ELISA檢測(cè)H1(0.01~1μM)對(duì)LPS(100 ng/ml)和Cp G DNA(10μg/ml)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放細(xì)胞因子TNF-α的抑制作用;盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecal ligation and puncture,CLP)建立膿毒癥小鼠模型,采用尾靜脈給藥方式,觀察H1(1~10μg/kg)對(duì)模型小鼠的保護(hù)作用。結(jié)果:1.闡明了KB與LPS和Cp G DNA的結(jié)合模式,KB主要以氫鍵和疏水作用與LPS和Cp G DNA結(jié)合。KB與LPS結(jié)合的主要位點(diǎn)位于LPS的磷酸官能團(tuán),同時(shí)也與其脂肪酸和Kdo側(cè)鏈有結(jié)合作用;KB與Cp G DNA結(jié)合的主要部位在于其GACGTT這一核心序列;2.設(shè)計(jì)了9個(gè)系列共計(jì)31個(gè)KB衍生物,虛擬篩選預(yù)測(cè)衍生物E1和H1活性?xún)?yōu)于KB,對(duì)此我們進(jìn)行了化學(xué)合成。此外,我們還選擇了預(yù)測(cè)活性與KB相當(dāng)?shù)腁1和活性顯著下降的SPM作為陰性對(duì)照進(jìn)行了測(cè)試;3.體外生物傳感器、鱟試劑檢測(cè)以及ELISA檢測(cè)結(jié)果從不同角度顯示,H1活性最好。在RAW264.7細(xì)胞模型上,對(duì)LPS和Cp G DNA誘導(dǎo)釋放TNF-α的抑制作用分別比KB提高了1倍和5倍。在CLP模型動(dòng)物上,H1顯著提高動(dòng)物存活率,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,并呈劑量-效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系。結(jié)論:通過(guò)對(duì)KB與LPS和Cp G DNA結(jié)合作用的研究,闡明了KB雙靶標(biāo)作用的結(jié)構(gòu)特征與基礎(chǔ)。KB主要通過(guò)氫鍵和疏水作用與LPS和Cp G DNA的關(guān)鍵位點(diǎn)結(jié)合,從而阻斷它們與各自受體的作用。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)、篩選出了具有更好活性的衍生物H1。該研究對(duì)全面闡釋KB的作用機(jī)制具有重要意義,也為進(jìn)一步深入進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化與合理藥物設(shè)計(jì),發(fā)現(xiàn)更好的抗膿毒癥藥物奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective : sepsis ( sepsis ) is a common fatal complication in patients with severe sepsis . The binding effect of KB and LPS and Cp G DNA was studied by means of molecular interaction dynamics and thermodynamic analysis and molecular docking . The inhibitory effect of KB on the release of TNF - 偽 in RAW264.7 cells induced by LPS ( 100 ng / ml ) and Cp G DNA ( 10 渭g / ml ) by enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ) was studied . Better anti - sepsis drugs are found to lay the foundation .
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R91;R914.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1924003