本文選題：穿膜肽 + 量子點(diǎn)　； 參考：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：目的探討應(yīng)用異型雙功能蛋白偶聯(lián)劑衍生物硫代琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺甲基)-環(huán)己烷-1-羧化物(Sulfo-SMCC)制備穿膜肽-p-葡萄糖苷酶-西妥昔單抗偶聯(lián)物的可行性,同時(shí)檢測偶聯(lián)物中的穿膜肽活性、p-葡萄糖苷酶活性及西妥昔單抗活性,為下一步研究其抗腫瘤效應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。方法1、采用Sulfo-SMCC將氨基水溶性量子點(diǎn)與巰基化穿膜肽進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)。將偶聯(lián)后的穿膜肽-量子點(diǎn)和人膀胱癌EJ細(xì)胞共培養(yǎng),檢測穿膜肽的活性。2、應(yīng)用硫代琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺甲基)-環(huán)己烷-1-羧化物(Sulfo-SMCC)將西妥昔單抗、p-葡萄糖苷酶進(jìn)行偶聯(lián)。采用SDS-PAGE、比色法、NHS-Alexa Fluor 488標(biāo)記偶聯(lián)物進(jìn)行鑒定二聯(lián)偶聯(lián)物并檢測β-葡萄糖苷酶、西妥昔單抗的活性。3、采用同上方法將穿膜肽、p-葡萄糖苷酶、西妥昔單抗進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián),制備穿膜肽-β-葡萄糖苷酶-西妥昔單抗三聯(lián)偶聯(lián)物。采用非還原型聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定三聯(lián)偶聯(lián)物的連接方式和成份；比色法鑒定三聯(lián)偶聯(lián)物酶活性；采用NHS-Alexa Fluor 488對(duì)偶聯(lián)物進(jìn)行熒光標(biāo)記,然后將穿膜肽-β-葡萄糖苷酶-西妥昔單抗三聯(lián)物和EJ細(xì)胞共培養(yǎng),檢測三聯(lián)偶聯(lián)物中的穿膜肽活性及抗體活性。結(jié)果1、穿膜肽活性鑒定結(jié)果：將穿膜肽-量子點(diǎn)與EJ細(xì)胞分別共培養(yǎng)1小時(shí)和2小時(shí)后,在Olympus BX51正置熒光顯微鏡下觀察到隨著時(shí)間的延長,人膀胱癌EJ細(xì)胞內(nèi)的紅色熒光越來越明顯,而對(duì)照組未見熒光,說明穿膜肽具有良好的穿膜活性。2、西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物的鑒定結(jié)果：SDS-PAGE結(jié)果示在3泳道高分子端可見清晰的條帶,而在β-葡萄糖苷酶、西妥昔單抗相對(duì)應(yīng)位置未見條帶。比色法結(jié)果示,等濃度二聯(lián)物的酶活性低于β-葡萄糖苷酶的酶活性(U/L：669.56±39.23 vs 870.60±61.34,t=7.863,P0.05),二聯(lián)物仍然具有良好酶活性。標(biāo)記有綠色熒光的西妥昔單抗-β-葡萄糖苷酶二聯(lián)物與EJ細(xì)胞共培養(yǎng)1小時(shí)后,置于Olympus BX51正置熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞周圍有綠色熒光,說明偶聯(lián)物仍然保持良好的抗體活性；3、穿膜肽-β-葡萄糖苷酶-西妥昔單抗偶聯(lián)物的鑒定結(jié)果：在電泳圖上可見到4泳道高分子端的清晰條帶,而在β-葡萄糖苷酶、穿膜肽-β-葡萄糖苷酶、西妥昔單抗相對(duì)應(yīng)位置未見條帶出現(xiàn)。比色法測定結(jié)果顯示,等濃度三聯(lián)物的酶活性低于β-葡萄糖苷酶(U/L:612.75110.58 vs 917.03±22.72,t=21.02,P0.05),但三聯(lián)物仍然保持有一定的酶活性。標(biāo)記有綠色熒光染料的穿膜肽-β-葡萄糖苷酶-西妥昔單抗三聯(lián)物與EJ細(xì)胞共培養(yǎng)1小時(shí)后,在Olympus BX51正置熒光顯微鏡下觀察到EJ細(xì)胞內(nèi)與周圍有明顯的綠色熒光,說明偶聯(lián)物仍保持良好的穿膜活性與抗體活性；結(jié)論Sulfo-SMCC可以將穿膜肽、β-葡萄糖苷酶、西妥昔單抗成功的偶聯(lián)在一起,同時(shí)三聯(lián)物仍能保持良好的穿膜肽活性、酶活性與抗體活性。該體系的建立為進(jìn)一步研究其抗腫瘤效應(yīng)奠定了基礎(chǔ),為抗體介導(dǎo)的酶前體藥物療法(ADEPT)的開發(fā)提供了新的思路,并且對(duì)浸潤性腫瘤的治療具有重要意義。
[Abstract]:Objective To investigate the feasibility of using heterobifunctional protein coupling agent derivative thiosuccinimide - 4 - ( N - maleimide methyl ) - cyclohexane - 1 - carboxylate ( Sulfo - SMCC ) to prepare the membrane - penetrating peptide - p - glucosidase - cetuximab conjugate .
identification of enzyme activity of triplet conjugate by colorimetric method ;
Results 1 . The results showed that the red fluorescence in human bladder cancer cell line was more and more obvious with the time extension . The results showed that the activity of 尾 - glucosidase was lower than that of 尾 - glucosidase ( U / L : 669.56 鹵 39.23 vs 870.60 鹵 61.34 , t = 7.863 , P0.05 ) .
3 . The results showed that the clear bands of 4 - lane polymer could be seen on the electrophoresis map , while the corresponding sites of 尾 - glucosidase , transmembrane peptide - 尾 - glucosidase and cetuximab were not observed . The results showed that the enzyme activity of the three - linked immunosorbent assay was lower than that of 尾 - glucosidase ( U / L : 612 . 75110.58 vs 917.03 鹵 22.72 , t = 21.02 , P0.05 ) .
Conclusion Sulfo - SMCC can successfully couple with membrane - penetrating peptide , 尾 - glucosidase and cetuximab , and it can maintain good membrane - penetrating peptide activity , enzyme activity and antibody activity . The establishment of the system lays a foundation for further research on its anti - tumor effect , provides a new idea for the development of antibody - mediated enzyme prodrug therapy ( ADEPT ) , and has important significance for the treatment of invasive tumors .
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R943;R927

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1918040