本文選題：達沙替尼(Dasatinib) + 自噬　； 參考：《浙江大學》2014年碩士論文

【摘要】：目的： 達沙替尼(Dasatinib)是臨床用于治療伊馬替尼耐藥的慢性粒性白血病(CML)的抗腫瘤藥物,為第二代小分子酪氨酸激酶抑制劑,同時正處于非小細胞肺癌的Ⅱ期臨床研究。但Dasatinib的肝臟毒性是其嚴重的不良反應(yīng)之一,極大的限制了Dasatinib的臨床應(yīng)用,深入研究Dasatinib肝臟毒性的分子機制和干預靶點具有深遠的意義。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)Dasatinib在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時,能引起肝臟細胞發(fā)生自噬。因此,本課題旨在研究自噬在Dasatinib肝臟毒性中的作用,進一步探索自噬發(fā)生的機制,并尋找可以保護Dasatinib誘導的肝臟毒性的小分子抑制劑,為Dasatinib肝臟毒性的保護提供實驗依據(jù),拓展其臨床應(yīng)用的廣度和深度。 方法： 采用裸小鼠移植瘤模型、ICR小鼠模型、大鼠原代肝臟細胞和永生化的人肝臟細胞Chang Liver,確證Dasatinib在臨床治療劑量下誘導肝臟毒性的同時可以激活自噬,并探討其對達沙替尼誘導的肝臟毒性的影響。(1)采用ICR小鼠模型,灌胃給予臨床治療CML劑量的Dasatinib30天后,通過檢測血清中血液生化指標谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)和HE染色法,研究Dasatinib引起的肝臟毒性。(2)采用A549裸小鼠移植瘤模型,灌胃給予臨床治療實體瘤劑量的Dasatinib,30天后從瘤重、腫瘤體積(TV)相對腫瘤體積(RTV)等方面評價Dasatinib的抗腫瘤效果。(3)檢測Dasatinib給藥后的血液生化指標ALT、AST和LDH的變化,并采用肝組織切片HE染色法,探索Dasatinib在發(fā)揮抗腫瘤藥效時的肝臟毒性。(4)采用免疫透射電鏡(TEM)、組織勻漿Western Blot法檢測肝組織中的自噬。(5)體內(nèi)給予營養(yǎng)劑與Dasatinib共同作用ICR小鼠,比較攝食量的變化,采用組織勻漿Western Blot、血液生化檢測和肝組織切片HE染色探索自噬發(fā)生的來源。(6)體外選用大鼠原代肝臟細胞,給予Dasatinib不同濃度和不同作用時間的處理,運用AO染色法、MDC染色法和Western Blot法研究自噬在Dasatinib肝臟毒性中的發(fā)生,并選用Western Blot法在永生化人肝臟細胞Chang Liver中確證自噬的發(fā)生。(7)體內(nèi)選用ICR小鼠,給予Dasatinib作用1到4周,每周處死4只,采用血液生化指標、HE染色和Western Blot法分析自噬與Dasatinib肝臟毒性出現(xiàn)的先后順序。(8)體外選用大鼠原代肝臟細胞和永生化的人肝臟細胞Chang Liver,給予3-MA和Dasatinib共同作用細胞,采用PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的變化,同時用Western Blot法檢測細胞自噬和凋亡相關(guān)蛋白LC3II/I、c-PARP、c-caspase-3的變化。(9)運用小分子RNA干擾技術(shù),沉默大鼠原代肝臟細胞中的自噬相關(guān)蛋白ATG-5,給予Dasatinib處理后24h,采用PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的變化,并用Western Blot法檢測自噬及凋亡相關(guān)蛋白LC3II/I、c-PARP、c-caspase-3的表達情況。(10)體內(nèi)采用ICR小鼠模型,給予3-MA和Dasatinib聯(lián)合給藥,30天后比較各組小鼠體重和死亡情況,采用TEM觀察肝組織自噬的變化,同時檢測血液生化指標ALT、AST和LDH的變化,并選取肝組織切片HE染色法,研究抑制自噬對Dasatinib誘導的肝臟毒性的影響。 采用大鼠原代肝臟細胞和永生化的人肝臟細胞Chang Liver,在體外探索自噬調(diào)控Dasatinib肝臟毒性的分子機制,并尋找干預靶點的小分子抑制劑。(1)采用大鼠原代肝臟細胞和永生化的人肝臟細胞Chang Liver,以Dasatinib作用細胞不同時間,檢測細胞活性氧簇(ROS)的變化情況。(2)采用大鼠原代肝臟細胞和永生化的人肝臟細胞Chang Liver,作用Dasatinib不同時間,Western Blot法檢測MAPK通路中JNK、ERK、p38及其磷酸化水平的變化。(3)運用小分子RNA干擾技術(shù),沉默大鼠原代肝臟細胞中MAPK通路蛋白JNK、ERK的表達,給予Dasatinib處理后24h,PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的變化,Western Blot法檢測自噬及凋亡相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、c-PARP、c-caspase-3的表達情況。(4)運用小分子RNA干擾技術(shù),沉默大鼠原代肝臟細胞和Chang Liver中MAPK通路蛋白p38的表達,給予不同濃度的Dasatinib作用24h后,PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的變化,Western Blot法檢測自噬及凋亡相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、c-PARP、 c-caspase-3的表達情況。(5)采用AO染色、MDC染色法,檢測p38激動劑異丙腎上腺素(ISO)與Dasatinib合用后大鼠原代肝臟細胞自噬的變化情況。(6)采用PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測鹽酸異丙腎上腺素(ISO)對Dasatinib誘導的大鼠原代肝臟細胞和Chang Liver細胞凋亡的影響。(7)采用Western Blot法檢測ISO對Dasatinib引起的大鼠原代肝臟細胞和Chang Liver細胞自噬和凋亡蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、c-PARP、c-caspase-3及p-p38變化的影響。 采用ICR小鼠研究鹽酸異丙腎上腺素(ISO)在體內(nèi)對Dasatinib肝臟毒性的保護作用；同時采用人非小細胞肺癌A549、前列腺癌PC3、乳腺癌MDA-MB-231、和A549裸小鼠移植瘤模型,研究ISO對Dasatinib抗腫瘤作用的影響。(1)采用ICR小鼠,灌胃給以Dasatinib和腹腔注射ISO聯(lián)合給藥30天,觀察小鼠體重、血液生化指標的變化,HE染色觀察肝臟組織損傷,研究ISO在體內(nèi)對Dasatinib肝臟毒性的影響。采用Western Blot法檢測小鼠肝臟中ISO對Dasatinib引起的凋亡蛋白c-PARP及c-caspase-3變化的影響。(2)采用Western Blot法檢測小鼠肝臟中ISO對Dasatinib引起的自噬蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ及p-p38變化的影響。(3)采用TEM觀察ISO在體內(nèi)對Dasatinib引起自噬的影響。(4)選取A549、PC3、MDA-MB-231三株腫瘤細胞,給予保護濃度的ISO和Dasatinib作用細胞24h,PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測ISO在體外對Dasatinib抗腫瘤作用的影響。(5)采用A549非小細胞肺癌裸小鼠移植瘤模型,灌胃給以Dasatinib和腹腔注射ISO聯(lián)合給藥30天,通過檢測瘤重、瘤體積、相對腫瘤體積,觀察ISO在體內(nèi)對Dasatinib抗腫瘤作用的影響。 結(jié)果： 1) Dasatinib在臨床治療劑量下誘導肝臟毒性的同時可以激活自噬,抑制自噬可以增強Dasatinib引起的肝臟毒性 Dasatinib25mg/kg灌胃給藥ICR小鼠30天后,與臨床報道一致的引起肝臟功能紊亂。Dasatinib50mg/kg灌胃給藥A549移植瘤裸小鼠30天后,與對照組相比,Dasatinib給藥組明顯抑制腫瘤生長,抑瘤率為55.9%,但Dasatinib給藥組的小鼠體重明顯下降,同時,血清中的肝酶ALT、AST、LDH含量是對照組的2-3倍,肝臟切片HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)Dasatinib引起多個區(qū)域的炎性反應(yīng),表明Dasatinib在發(fā)揮抗腫瘤活性的同時有明顯的肝臟毒性。采用組織電鏡檢測到Dasatinib組裸小鼠肝臟組織自噬泡的存在,Western Blot結(jié)果顯示Dasatinib組裸小鼠肝臟組織自噬標記蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)換明顯增加。另外,ICR小鼠給予Dasatinib30天,給藥期間給藥組與對照組小鼠平均攝食量沒有變化；給予營養(yǎng)劑和Dasatinib組的小鼠肝臟組織與未給予營養(yǎng)劑相比,仍有相同程度的LC3Ⅰ型向Ⅱ型轉(zhuǎn)換和血清生化指標的升高,HE染色觀察肝臟組織發(fā)現(xiàn)給予營養(yǎng)劑并不能逆轉(zhuǎn)Dasatinib誘導的肝組織損傷,表明肝臟中自噬的激活是Dasatinib誘導的,而不是營養(yǎng)缺乏所致。采用AO和MDC染色法檢測大鼠原代肝臟細胞內(nèi)自噬泡的產(chǎn)生和分布情況,結(jié)果表明,隨著Dasatinib作用時間和作用濃度的增加,標記酸性囊泡的紅色熒光和示蹤自噬泡的點狀熒光均逐漸增加,呈濃度和時間依賴性。Western Blot確證了自噬標記蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)換以及自噬底物蛋白p62的大量降解,表明Dasatinib在給藥后的組織和細胞中誘導自噬的發(fā)生。體內(nèi)ICR小鼠不同時間的血清及肝臟組織結(jié)果顯示,Dasatinib肝臟毒性出現(xiàn)在給藥第三周,而自噬出現(xiàn)在給藥第四周。體外肝細胞中2mM的3-MA與12.5μM的Dasatinib共同作用24h,與Dasatinib單用組相比有明顯的細胞凋亡率,同時伴隨著凋亡蛋白c-PARP和c-caspase-3的明顯增加。沉默大鼠原代肝細胞中ATG-5表達可以增加Dasatinib凋亡率和凋亡蛋白的表達；體內(nèi)ICR小鼠給予2mg/kg的3-MA和50mg/kg的Dasatinib組給藥30天后體重明顯低于Dasatinib單用組,同時有2只(n=6)小鼠死亡(其他各組無死亡),合用組血液生化指標ALT、AST、LDH明顯高于Dasatinib單用組,并且肝臟組織切片HE染色顯示出更強的損傷,說明抑制自噬可以增強Dasatinib的肝臟毒性。 2) Dasatinib引起的自噬是由p38-MAPK所介導的,小分子p38激動劑鹽酸異丙腎上腺素(ISO)可以通過激活p38介導的自噬保護Dasatinib的肝臟毒性。 流式細胞術(shù)檢測ROS顯示在Dasatinib作用0-7h的過程中,細胞中的ROS含量逐漸增高,并于7h達到最大。Western Blot結(jié)果顯示,Dasatinib作用后細胞中JNK、ERK、p38的磷酸化水平增強。用小分子RNA干擾技術(shù)將MAPK通路JNK、 ERK沉默后,發(fā)現(xiàn)Dasatinib誘導的細胞凋亡及凋亡蛋白c-PARP和c-caspase-3明顯減少,但對自噬關(guān)鍵蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ比例沒有影響。用小分子RNA干擾技術(shù)將MAPK通路p38沉默后,發(fā)現(xiàn)隨著Dasatinib給藥濃度的增加,其誘導的細胞凋亡及凋亡蛋白c-PARP和c-caspase-3逐漸增加,同時自噬關(guān)鍵蛋白LC3II/I的比例逐漸降低。AO、MDC染色結(jié)果顯示,10nM的ISO可以明顯增加Dasatinib引起的酸性囊泡。PI流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,原代肝細胞的凋亡率由Dasatinib單用組的48.0%減少到了ISO與Dasatinib合用組的26.0%；Chang liver細胞的凋亡率由單用組46.0%的減少到了合用組的26.0%。同時,Western Blot結(jié)果顯示,合用組ISO的自噬標記蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ比例明顯增加,而凋亡蛋白c-PARP和c-caspase-3明顯減少。這說明ISO在體外肝臟細胞中可以通過激活p38介導的自噬,保護Dasatinib的肝臟毒性。 3)ISO可以在體內(nèi)明顯保護Dasatinib誘導的肝臟毒性,同時在體內(nèi)外不影響Dasatinib的抗腫瘤活性 體內(nèi)ICR小鼠結(jié)果顯示,ISO8ng/kg與Dasatinib50mg/kg合用組可以明顯回調(diào)Dasatinib50mg/kg單用組引起的小鼠體重減輕,同時也降低Dasatinib累積的血清ALT、AST和LDH的升高；HE染色結(jié)果顯示ISO可以明顯減輕Dasatinib引起的小葉中心壞死、彌漫性肝變性和慢性多灶點炎癥。同時,Western Blot結(jié)果顯示,ISO在小鼠肝臟中可以明顯降低Dasatinib引起的凋亡蛋白c-PARP和c-caspase-3的表達。進一步的,TEM和Western blot的結(jié)果確證了,ISO在小鼠肝臟細胞中可以明顯增強Dasatinib誘導的自噬。在體外三株腫瘤細胞A549、PC3、MDA-MB-231中,10nM的ISO與10μM的Dasatinib合用不會降低Dasatinib的抗腫瘤活性。同時在體內(nèi)A549裸小鼠移植瘤模型中,8ng/kg的ISO不影響50mg/kg的Dasatinib的抗腫瘤作用。說明ISO在保護Dasatinib引起的肝臟毒性的同時,不會影響其抗腫瘤效果。 結(jié)論： 本課題揭示了Dasatinib在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時具有明顯的肝臟損傷,而通過p38介導的保護性自噬可以對抗Dasatinib誘導的肝臟毒性,闡明了Dasatinib肝損傷的新機制。同時,鹽酸異丙腎上腺素(ISO)可以在不影響Dasatinib抗腫瘤作用的同時明顯改善Dasatinib誘導的肝臟功能下降,為臨床Dasatinib的廣泛應(yīng)用及其肝臟毒性的防治提供了新穎的、可行的理論基礎(chǔ)。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R965

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 ;Role of autophagy in liver physiology and pathophysiology[J];World Journal of Biological Chemistry;2010年01期

2 ;Ischemic preconditioning protects liver from hepatectomy under hepatic inflow occlusion for hepatocellular carcinoma patients with cirrhosis[J];World Journal of Gastroenterology;2004年17期

3 Terrence M Donohue Jr;;Autophagy and ethanol-induced liver injury[J];World Journal of Gastroenterology;2009年10期

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本文編號：1916073