發(fā)布時(shí)間：2018-05-20 11:01

  本文選題：尖銳濕疣 + 人乳頭瘤病毒��； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2016年博士論文

【摘要】：尖銳濕疣是由人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)引起的一種性傳播疾病,其主要的病原體為HPV 6型和11型。尖銳濕疣的發(fā)病率逐年升高,日益成為嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題。由于HPV的種屬特異性以及生命周期對細(xì)胞分化的依賴性,HPV的體內(nèi)、體外感染模型發(fā)展緩慢,使HPV生物學(xué)行為的研究以及抗HPV藥物研發(fā)受到限制。本課題基于課題組的以往研究,利用已有方法建立含HPV 11游離基因的HaCaT重組細(xì)胞(HPV11.HaCaT細(xì)胞),從細(xì)胞生長特性、病毒功能基因的表達(dá),以及病毒基因?qū)?xì)胞內(nèi)微環(huán)境的影響等方面考核HPV11.HaCaT重組細(xì)胞作為抗HPV 11體外藥效學(xué)模型的完整性；并通過幾種化合物在該系統(tǒng)中的實(shí)踐性應(yīng)用,探索該系統(tǒng)作為體外篩選抗HPV 11藥物時(shí)藥效指標(biāo)確立的可行性,為后續(xù)向藥效學(xué)模型轉(zhuǎn)化的深入研究提供數(shù)據(jù);同時(shí)Affymetrix基因表達(dá)譜芯片的結(jié)果為后續(xù)研究提示新的思路。第一部分HPV11.HaCaT重組細(xì)胞作為體外藥效模型的完整性研究目的：構(gòu)建含HPV11游離基因的HaCaT重組細(xì)胞,并驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)和功能的完整性。方法：利用全基因轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建HPV11.HaCaT細(xì)胞,通過測定生長曲線及流式細(xì)胞術(shù)分別檢測細(xì)胞在基底樣培養(yǎng)和分化狀態(tài)培養(yǎng)時(shí)的生長特性;利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及細(xì)胞免疫熒光驗(yàn)證基底樣及分化狀態(tài)下HPV11.HaCaT細(xì)胞中HPV11早期基因mRNA及蛋白的表達(dá)；利用Western Blot法研究HPV11.HaCaT細(xì)胞I型IFN通路的活化：利用基因沉默技術(shù)干擾重組細(xì)胞內(nèi)HPV11E7基因,檢測E7基因?qū)χ亟M細(xì)胞內(nèi)I型IFN信號通路激活的影響。結(jié)果：(1)利用前期所建方法成功構(gòu)建的HPV11.HaCaT重組細(xì)胞。與正常HaCaT細(xì)胞相比,重組細(xì)胞在一定程度上生長速度加快,S期細(xì)胞數(shù)顯著增多。重組細(xì)胞中可成功檢測到HPV11早期基因E1∧E4、E5、E6、 E7mRNA及E7蛋白的表達(dá)。(2)利用甲基纖維素半固體培養(yǎng)可成功使HPV11.HaCaT細(xì)胞趨于分化,終末分化指示內(nèi)披蛋白高表達(dá),分化狀態(tài)HPV11.HaCaT細(xì)胞較基底樣細(xì)胞的生長增殖加快,且細(xì)胞內(nèi)HPV11 E5、E6、E7mRNA及E7蛋白的表達(dá)均上調(diào)。(3)外源性rhIFN-α刺激后,HPV11.HaCaT細(xì)胞內(nèi)IFN信號通路可被激活,但胞內(nèi)JAK/STAT通路的激活水平低于正常HaCaT細(xì)胞。(4)用Poly (I:C)刺激HPV11.HaCaT細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)NF-κB相關(guān)蛋白可活化,但活化水平與正常HaCaT細(xì)胞差異不大。(5)通過siRNA可以成功干擾HPV11.HaCaT細(xì)胞中HPV11 E7表達(dá),干擾后的細(xì)胞內(nèi)IFN信號通路激活情況發(fā)生變化。結(jié)論：通過全基因轉(zhuǎn)染后成功構(gòu)建的HPV1 1.HaCaT細(xì)胞在生長特性、病毒功能基因的完整表達(dá),以及病毒基因組對細(xì)胞內(nèi)IFN信號通路的影響等方面均提示該細(xì)胞模型作為體外感染模擬系統(tǒng)具有一定的完整性。第二部分HPV11.HaCaT重組細(xì)胞作為體外藥效模型的應(yīng)用性研究目的：通過幾種化合物在HPV11.HaCaT細(xì)胞中的實(shí)踐性應(yīng)用,探索該系統(tǒng)作為體外篩選抗HPV11藥物時(shí)藥效指標(biāo)確立的可行性。方法：利用MTT法探索rhIFN-α和 rhIFN-ω,化合物表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、姜黃素,以及ALA-PDT的治療方法對HPV11.HaCaT細(xì)胞細(xì)胞生長增殖的影響；以HPV11 E6、E7作為指標(biāo),通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定上述受試物或治療方法對HPV11.HaCaT重組細(xì)胞中HPV11 E6、E7mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果：(1)rhIFN-α及 rhIFN-ω對 HPV11.HaCaT細(xì)胞的增殖無明顯抑制作用;EGCG及姜黃素對HPV11.HaCaT細(xì)胞的生長有一定的抑制作用,并呈劑量和時(shí)間依賴趨勢；0.75mmol/L以上濃度的5-ALA聯(lián)合20J/cm2以上劑量紅光照射可抑制HPV11.HaCaT細(xì)胞增殖。(2) 102 IU/ml rhIFN-α及 rhIFN-ω可上調(diào)HPV11.HaCaT細(xì)胞中E6、E7 mRNA表達(dá),但103IU/ml及以上濃度的rhIFN-α及 rhIFN-ω均可明顯抑制HPV11 E6、E7 mRNA表達(dá)；EGCG及姜黃素均明顯抑制HPV11.HaCaT細(xì)胞中HPV11E6、E7 mRNA表達(dá);0.375mmol/L 5-ALA聯(lián)合20 J/cm2紅光照射即可以顯著抑制HPV11 E6、E7 mRNA的表達(dá)。(3)受試物作用于分化狀態(tài)的HPV11.HaCaT細(xì)胞后,104 IU/ml rhIFN-α可對HPV11 E6、E7mRNA表達(dá)產(chǎn)生顯著抑制作用,但EGCG及姜黃素的抑制作用較弱或無明顯抑制作用。結(jié)論：在HPV11.HaCaT重組細(xì)胞系統(tǒng)中,細(xì)胞增殖反映了受試物對感染細(xì)胞生長的影響,可作為藥效指標(biāo)之一,但此作用是非特異性的。通過測定HPV11 E6、 E7 mRNA表達(dá),可以測試受試物針對細(xì)胞中病毒早期基因的影響,因此可作為較特異的藥效指標(biāo)。以上結(jié)果提示HPV11.HaCaT重組細(xì)胞轉(zhuǎn)化為抗HPV11體外藥效學(xué)模型的可行性。第三部分通過Affymetrix基因表達(dá)譜芯片探索HPV11.HaCaT重組細(xì)胞后續(xù)研究的方向目的：利用基因表達(dá)譜芯片探索負(fù)載HPV11基因組后,載體HaCaT細(xì)胞內(nèi)mRNA水平發(fā)生的改變,為后續(xù)深入研究打下基礎(chǔ)。方法：利用Affymetrix基因表達(dá)譜芯片,對比HPV11.HaCaT細(xì)胞及HaCaT細(xì)胞中基因組mRNA的差異。結(jié)果：與HaCaT細(xì)胞相比,HPV11.HaCaT細(xì)胞中有808種基因上調(diào),900中基因下調(diào)。Pathway富集分析后,根據(jù)P值排序,第一位為系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)基因,第二位為腫瘤相關(guān)基因。結(jié)論：后續(xù)研究中可以將HPV11.HaCaT細(xì)胞作為探索研究HPV11基因與宿主細(xì)胞間相互關(guān)系的HPV11感染細(xì)胞模型。
[Abstract]:HPV 11 . HaCaT cells ( HPV11 . HaCaT cells ) have been established by the methods of human papillomavirus ( HPV ) .
In this paper , the feasibility of the application of several compounds in the system was explored . The feasibility of the system as an in vitro screening of anti - HPV 11 drug was explored . The results of the analysis of the expression profiles of human papillomavirus 11 . HaCaT cells were used to construct HPV11 . HaCaT cells were used to construct HPV11 . HaCaT cells were used to test the growth characteristics of HPV11 . HaCaT cells in the culture and differentiation of HPV11 . The expression of HPV11 mRNA and protein in HPV11 . HaCaT cells was verified by polymerase chain reaction ( PCR ) and immunofluorescence assay .
The expression of HPV11 , E6 , E6 , E7 mRNA and E7 protein in HPV11 and HaCaT cells was detected by Western Blot .
Results : ( 1 ) rhIFN - 偽 and rhIFN - 蠅 did not inhibit the proliferation of HPV11 . HaCaT cells . The results showed that ( 1 ) rhIFN - 偽 and rhIFN - 蠅 inhibited HPV11 . HaCaT cell proliferation .
( 2 ) 102 IU / ml rhIFN - 偽 and rhIFN - 蠅 could up - regulate the expression of E6 , E7 mRNA in HPV11 . HaCaT cells , but rhIFN - 偽 and rhIFN - 蠅 at 103IU / ml and above could significantly inhibit the expression of HPV11 E6 and E7 mRNA .
The expression of HPV11 E6 , E7 mRNA in HPV11 and HaCaT cells was significantly inhibited by the expression of HPV11 E6 and E7 mRNA .
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R96

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 劉建;利用微囊化重組細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)異源蛋白[J];國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊;1999年05期

2 于洪濤;夏天瑤;張興義;;基因重組細(xì)胞在大規(guī)模長期培養(yǎng)中培養(yǎng)條件對HBsAg表達(dá)的影響[J];中國生物制品學(xué)雜志;1993年02期

3 Conradt MS;毛存貴;;人糖蛋白在哺乳動(dòng)物重組細(xì)胞中的表達(dá)N-和O-連接的糖蛋白的基因工程[J];國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊);1991年02期

4 ;[J];;年期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 孫洋;HPV11.HaCaT重組細(xì)胞作為體外藥效學(xué)模型的完整性和應(yīng)用性研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 張曉媛;帶有熒光標(biāo)簽的NPFF2受體重組細(xì)胞模型建立[D];蘭州大學(xué);2013年

，

本文編號：1914353