本文選題：人胚胎干細(xì)胞 + TALEN　； 參考：《吉林大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：人肝細(xì)胞作為檢測藥物吸收、分布、代謝、排泄及毒性的體外實驗金標(biāo)準(zhǔn)模型之一，被廣泛應(yīng)用于臨床前藥物研究。CYP3A亞家族是細(xì)胞色素P450酶系家族中最為重要的成員，它在肝CYP中含量最高，在肝細(xì)胞對于藥物代謝和解讀功能中承擔(dān)著50%的作用。 新鮮分離的人原代肝臟細(xì)胞是用于藥物研發(fā)以及生物人工肝的最理想細(xì)胞來源，但是由于肝臟供體的嚴(yán)重稀缺以及體外表型維持困難等特點，極大地限制了其應(yīng)用；而其他的以細(xì)胞為基本單位成分的分析模型，，如其他動物來源的原代肝臟細(xì)胞，或人肝癌細(xì)胞系，其代謝酶類和表達(dá)譜皆不能真實地反應(yīng)正常人肝細(xì)胞的生理表現(xiàn)，例如在一些肝癌細(xì)胞系中很多代謝酶的水平與人原代成體肝細(xì)胞呈指數(shù)級的差異；干細(xì)胞體外定向分化研究的進(jìn)展，使來自于干細(xì)胞的肝細(xì)胞成為最接近正常人原代肝細(xì)胞來源成為可能，然而目前遇到的共性問題是這種在體外定向分化得到的肝細(xì)胞，往往在功能上不成熟，表現(xiàn)為參與藥物代謝的重要P450蛋白表達(dá)量低，不能表達(dá)成熟肝細(xì)胞特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子或蛋白質(zhì)；或者這種具備條件的成熟數(shù)量極少，很難區(qū)分，因此也很難大規(guī)模應(yīng)用。目前尚缺乏能在體外識別信號通路的調(diào)節(jié)和代謝功能的可靠工具。 本研究首次報道了利用TALEN技術(shù)構(gòu)建了打靶的人胚胎干細(xì)胞系，在體外直接分化成為具有功能性的肝細(xì)胞；這一被標(biāo)記的干細(xì)胞分化體系可以識別能夠促進(jìn)CYP3A4表達(dá)的候選者。基于TALEN打靶技術(shù)，我們將增強型綠色熒光蛋白eGFP的基因片段插入到CYP3A4基因的外顯子區(qū)域，使得eGFP能夠有效的被CYP3A4的啟動子調(diào)控。這一敲入CYP3A4:eGFP的細(xì)胞系在體外被定向誘導(dǎo)分化為人肝細(xì)胞，利用GFP作為CYP3A4的報告基因，沿用前人報道的體外定向誘導(dǎo)分化的方法，驗證了這一基因報告細(xì)胞系具有和野生型人胚胎干細(xì)胞系同樣的分化潛能；同時，這個基因標(biāo)記的人胚胎干細(xì)胞系能夠正確反映在細(xì)胞分化過程中CYP3A4基因的實際表達(dá)情況，可以作為篩選影響肝臟細(xì)胞成熟過程中關(guān)鍵因子的體系。 然后，利用這一被標(biāo)記的干細(xì)胞分化體系，我們在肝臟細(xì)胞發(fā)育的前體階段加入了不同的細(xì)胞因子，以期篩選出促進(jìn)功能性肝細(xì)胞分化的因子。研究表明表皮生長因子EGF可以作為一個信號蛋白有效地促進(jìn)和維持人肝細(xì)胞在體外CYP3A4的表達(dá)。相對于傳統(tǒng)的分化體系，添加了EGF的分化體系使得在體外分化的人肝細(xì)胞從5.9%增加到40.2%。隨后，我們將分化得到的肝細(xì)胞移植到肝損傷小鼠URG（Tet-uPA/Rag2-/-/Il2rg-/-）體內(nèi)，2周后在小鼠的血清中即檢測到了人白蛋白的表達(dá)，證明分化的細(xì)胞具有移植重建肝臟的能力。 本研究從實用的角度出發(fā)，建立了一種便于操作，直觀觀察即能評價體外分化的肝臟細(xì)胞成熟情況的有效篩選體系；以此為基礎(chǔ)，可以對現(xiàn)有的分化體系進(jìn)行培養(yǎng)條件、誘導(dǎo)時間等方面的優(yōu)化，以提高分化效率。同時，通過該體系的應(yīng)用，我們發(fā)現(xiàn)EGF作為一個新的調(diào)節(jié)蛋白在CYP3A4基因表達(dá)中起到了至關(guān)重要的作用。更為重要的是，用此評價體系得到的肝臟細(xì)胞具有和人成體肝臟細(xì)胞相類似的蛋白表達(dá)和mRNA轉(zhuǎn)錄水平，用該體系評價出來的細(xì)胞極有可能成為藥物開發(fā)中檢測肝臟毒性、藥物相互作用評估的工具�；赥ALEN技術(shù)的基因打靶，與人胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞定向分化體系的結(jié)合，可以成為在體外獲得穩(wěn)定代謝功能的人肝細(xì)胞的可靠篩選模型，從而為以后提供供體細(xì)胞、建立人源化動物模型在體研究和應(yīng)用分化的干細(xì)胞進(jìn)行體外藥物篩選都具有著十分重要的意義。
[Abstract]:Human hepatocytes are one of the gold standard models for the detection of drug absorption, distribution, metabolism, excretion and toxicity in vitro. The.CYP3A subfamily is the most important member of the cytochrome P450 enzyme family, which is the most important member of the cytochrome CYP family. It has the highest content in the liver CYP, and is responsible for the metabolism and interpretation of the liver cells in the liver cells. The role of 0%.
Fresh isolated human primary liver cells are the most ideal source of cell for drug development and bioartificial liver. However, due to the severe scarcity of the liver donor and the difficulty of maintaining the phenotypes in vitro, its application is greatly limited; other analytical models, such as other animal sources, are the basic units of cells. The metabolic enzymes and expression profiles of the liver cells, or human hepatoma cells, can not truly reflect the physiological performance of normal human hepatocytes. For example, many metabolic enzymes in some liver cancer cells are at an exponential level with those of human primary hepatocytes; the progress in the study of stem cell differentiation in vitro is derived from stem cells. Hepatocyte becomes the closest source of primary hepatocyte origin to normal people. However, the common problem is that the liver cells that have been differentiated in vitro are often immature in function, showing the low expression of important P450 proteins involved in drug metabolism, and can not reach a transcriptional factor or protein expressed by the mature hepatocytes. It is difficult to discriminate, and therefore difficult to be used in large-scale applications. There is still a lack of reliable tools to identify the regulatory and metabolic functions of the signaling pathways in vitro.
This study is the first to report the use of TALEN technology to build a target human embryonic stem cell line, which is directly differentiated into functional liver cells in vitro; this labeled stem cell differentiation system can identify candidates for the promotion of CYP3A4 expression. Based on TALEN targeting, we will enhance the gene for enhanced green fluorescent protein eGFP The fragment was inserted into the exons of the CYP3A4 gene so that eGFP could be effectively regulated by the promoter of the CYP3A4. The cell line that entered CYP3A4:eGFP was directed to differentiate into human hepatocytes in vitro, and GFP was used as a reporter gene for CYP3A4. The gene report was used to verify the gene report. The cell line has the same differentiation potential as the wild human embryonic stem cell line. At the same time, the human embryonic stem cell line marked by this gene can correctly reflect the actual expression of CYP3A4 gene in the process of cell differentiation, and can be used as a system to screen the key factors in the process of liver cell maturation.
Then, using this labeled stem cell differentiation system, we added different cytokines to the precursors of the liver cell development in order to screen out factors that promote functional hepatocyte differentiation. The study shows that epidermal growth factor EGF can effectively promote and maintain human hepatocytes in CYP3A4 as a signal protein. Compared with the traditional differentiation system, the differentiation system of EGF was added to increase the differentiation of human hepatocytes from 5.9% to 40.2%., and the differentiated hepatocytes were transplanted into the liver injury mice URG (Tet-uPA/Rag2-/-/Il2rg-/-). After 2 weeks, the expression of human albumin was detected in the blood albumin of the mice. The transformed cells have the ability to transplant and reconstruct the liver.
From a practical point of view, this research establishes an effective screening system which is convenient for operation and intuitionistic observation that can evaluate the maturation of liver cells differentiated in vitro. Based on this, we can optimize the existing differentiation system and induce time to improve the differentiation efficiency. At the same time, through the application of the system, We found that EGF plays a vital role in the expression of CYP3A4 gene as a new regulatory protein. More importantly, the liver cells obtained by this evaluation system have a similar protein expression and mRNA transcriptional level with human adult liver cells, and the cells evaluated with this system are extremely likely to become drug development. A tool for the detection of liver toxicity and drug interaction. Based on the gene targeting of TALEN technology and the combination of human embryonic stem cells to the directional differentiation system of liver cells, it can be a reliable screening model for human liver cells with stable metabolism in vitro, thus providing donor cells and establishing a humanized animal model for the future. Research and differentiation of stem cells in vitro drug screening are of great significance.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R96

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳健;何成奇;;人胚胎干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J];中國老年學(xué)雜志;2010年17期

2 余國膺;細(xì)胞起搏器研究深入一步:基因工程制成的人胚胎干細(xì)胞具有電活動的心臟生出物與受體不活動心室細(xì)胞的功能整合[J];中國心臟起搏與心電生理雜志;2005年03期

3 侯穎;周健;王衡;;胚胎干細(xì)胞及其應(yīng)用前景[J];華北煤炭醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2006年04期

4 郭世琮;;克隆:處在十字路口的醫(yī)學(xué)革命[J];科學(xué)世界;2001年01期

5 楊鵬飛,叢笑倩,程啟康,華澤釗,吳春芳,曹誼林;人胚胎干細(xì)胞程序降溫保存的實驗研究[J];實驗生物學(xué)報;2005年03期

6 ;人胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞[J];現(xiàn)代醫(yī)院;2008年08期

7 葛均波,張少衡;干細(xì)胞能再生梗死心肌嗎?[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2005年36期

8 張?zhí)锟?高文哲;;戴著腳鐐的胚胎干細(xì)胞研究[J];新知客;2007年01期

9 范新蘭;孟春玲;麥友剛;徐令;;人胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的體外實驗(英文)[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2007年46期

10 安克;;胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞進(jìn)展[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2008年12期

相關(guān)會議論文 前10條

1 韋東;;人胚胎干細(xì)胞相關(guān)發(fā)明可專利性研究[A];發(fā)展知識產(chǎn)權(quán)服務(wù)業(yè)，支撐創(chuàng)新型國家建設(shè)-2012年中華全國專利代理人協(xié)會年會第三屆知識產(chǎn)權(quán)論壇論文選編(第一部分)[C];2011年

2 吳應(yīng)積;FenhuaLuo;Aileen Lu;John W.McDanold;;間隙連接蛋白在人胚胎干細(xì)胞中的表達(dá)[A];第九次全國生殖生物學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2003年

3 李藝;張祖娟;崔恒;;人胚胎干細(xì)胞作為腫瘤疫苗的初步研究[A];中華醫(yī)學(xué)會腫瘤學(xué)分會第七屆全國中青年腫瘤學(xué)術(shù)會議——中華醫(yī)學(xué)會腫瘤學(xué)分會“中華腫瘤 明日之星”大型評選活動暨中青年委員全國遴選論文匯編[C];2011年

4 趙惠萍;王綺如;程臘梅;譚孟群;;誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向造血細(xì)胞分析[A];第九屆全國實驗血液學(xué)會議論文摘要匯編[C];2003年

5 羅向東;;人胚胎干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及應(yīng)用前景[A];中華醫(yī)學(xué)會第六屆全國燒傷外科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2001年

6 劉超;劉麗華;陳曉蓉;方圣云;;人胚胎干細(xì)胞無滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)方法與應(yīng)用[A];中國解剖學(xué)會2011年年會論文文摘匯編[C];2011年

7 魏蕊;劉國強;楊進(jìn);侯文芳;高美娟;陳貴安;洪天配;;人胚胎干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化過程中miRNA表達(dá)的動態(tài)變化[A];中華醫(yī)學(xué)會第十次全國內(nèi)分泌學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2011年

8 劉永剛;王亞平;;用于人胚胎干細(xì)胞研究的飼養(yǎng)層的分離和培養(yǎng)[A];解剖學(xué)雜志——中國解剖學(xué)會2002年年會文摘匯編[C];2002年

9 陳曦;劉斌;;人胚胎干細(xì)胞(EG細(xì)胞)體外培養(yǎng)并分化為心肌細(xì)胞[A];解剖學(xué)雜志——中國解剖學(xué)會2002年年會文摘匯編[C];2002年

10 張麗瑞;李旭;陳葳;;人胚胎干細(xì)胞建系的方法學(xué)研究進(jìn)展[A];全國首屆動物生物技術(shù)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2004年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 ;人胚胎干細(xì)胞研究倫理指導(dǎo)原則[N];健康報;2004年

2 記者左朝勝;人胚胎干細(xì)胞建系報道多有出入[N];科技日報;2002年

3 張荔子;禁止克隆人和買賣人類胚胎[N];健康報;2004年

4 王洋;胚胎干細(xì)胞是“人”嗎？[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2002年

5 翟紅剛 記者 孫明河;煙臺十個“單打冠軍”換來一個“團(tuán)體亞軍”[N];科技日報;2003年

6 本報記者 白毅;胚胎干細(xì)胞讓人歡喜讓人憂[N];中國醫(yī)藥報;2002年

7 聶翠蓉;盛慧珍，在治療性胚胎克隆前沿領(lǐng)跑[N];科技日報;2003年

8 張倫;21世紀(jì)科研熱點——干細(xì)胞研究[N];中國醫(yī)藥報;2001年

9 本報記者 李天舒;該怎么看待“人造生命”[N];健康報;2010年

10 記者　楊永林;西北農(nóng)林科技大學(xué)喜迎建校70周年[N];光明日報;2004年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 歐陽琦;解決人胚胎干細(xì)胞免疫排斥的方法研究[D];中南大學(xué);2010年

2 魯振宇;人胚胎干細(xì)胞系與人孤雌胚胎干細(xì)胞系建立的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2010年

3 蘇位君;人胚胎干細(xì)胞來源內(nèi)皮細(xì)胞作為細(xì)胞載體對轉(zhuǎn)移性乳腺癌進(jìn)行靶向治療的研究[D];南開大學(xué);2012年

4 王芳;多囊卵巢綜合征源性人胚胎干細(xì)胞系的建立及分化為脂肪細(xì)胞的相關(guān)研究[D];鄭州大學(xué);2010年

5 尹明;基于基因打靶技術(shù)的人胚胎干細(xì)胞向功能性肝細(xì)胞分化的研究[D];吉林大學(xué);2014年

6 王茍思義;新基因HESRG在人胚胎干細(xì)胞中的功能、表達(dá)調(diào)控及其在人類顱內(nèi)腫瘤的表達(dá)[D];中南大學(xué);2012年

7 宦晴;人胚胎干細(xì)胞生物學(xué)性狀及向內(nèi)皮分化過程中ID-1基因作用的研究[D];山東大學(xué);2010年

8 陳雪梅;人胚胎干細(xì)胞傳代培養(yǎng)和神經(jīng)誘導(dǎo)分化過程中基因組遺傳變異的動態(tài)變化[D];鄭州大學(xué);2013年

9 吳蓉蓉;人胚胎干細(xì)胞建系，鑒定及分化為多能性間充質(zhì)樣前體細(xì)胞[D];浙江大學(xué);2009年

10 吳瓊;人胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)生成內(nèi)皮祖細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)腫瘤生長的作用研究及機制初探[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 董立平;兩種信息可視化工具在學(xué)科知識領(lǐng)域應(yīng)用的比較研究——人胚胎干細(xì)胞文獻(xiàn)分析[D];中國醫(yī)科大學(xué);2010年

2 韋東;人胚胎干細(xì)胞相關(guān)發(fā)明可專利性研究[D];華東政法大學(xué);2011年

3 劉李棟;人胚胎干細(xì)胞相關(guān)發(fā)明的可專利性[D];上海交通大學(xué);2012年

4 魏晉;人胚胎干細(xì)胞向心室和心房肌細(xì)胞分化和富集的研究[D];西南大學(xué);2012年

5 羅建;雙酚A對人胚胎干細(xì)胞擬胚體發(fā)育的影響：初步的基因組學(xué)研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2012年

6 喻松霞;人胚胎干細(xì)胞無血清無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系的建立[D];南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院;2013年

7 徐蘭;人胚胎干細(xì)胞全機械法建系及定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的研究[D];上海交通大學(xué);2012年

8 鄭東燕;SWI/SNF染色體重塑復(fù)合物在人胚胎干細(xì)胞中的功能研究[D];華東師范大學(xué);2011年

9 馬麗娟;SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物在人胚胎干細(xì)胞中的組成及其作用伴侶的研究[D];華東師范大學(xué);2012年

10 賀菁菁;人胚胎干細(xì)胞向胰島素陽性細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系的優(yōu)化[D];中南大學(xué);2013年

本文編號：1903690