本文選題：腫瘤轉(zhuǎn)移 + 血管新生�。� 參考：《浙江大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：研究目的：腫瘤轉(zhuǎn)移是抗腫瘤治療的熱點問題,但因其病理過程的復(fù)雜性,目前仍缺乏有效的針對性藥物。非甾體類抗炎藥阿司匹林,在臨床上應(yīng)用已經(jīng)超過百余年,近年來大量流行病學(xué)調(diào)查顯示,阿司匹林具有明顯的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。通過前期針對阿司匹林的藥物-蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),硫酸乙酰肝素酶為其潛在作用靶點。本研究全面評價乙酰肝素酶作為阿司匹林靶點的生物學(xué)特性,并考察阿司匹林通過乙酰肝素酶發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。方法與結(jié)果：第一部分阿司匹林抑制乙酰肝素酶酶活機(jī)制探討構(gòu)建HTRF法篩選乙酰肝素酶抑制劑的分子平臺,并以HTRF法篩選化合物庫,結(jié)果顯示阿司匹林具有明顯的抑制乙酰肝素酶作用。Pull-down結(jié)合冷探針競爭實驗結(jié)果顯示,阿司匹林能夠與乙酰肝素酶結(jié)合；SPR檢測表明,二者結(jié)合于非肝素類結(jié)合位點。利用分子模擬技術(shù),模擬阿司匹林、水楊酸及Biotin-阿司匹林與乙酰肝素酶的結(jié)合模式,阿司匹林可能結(jié)合于乙酰肝素酶的G]u225位酶活性區(qū)域。第二部分阿司匹林對乙酰肝素酶引起的相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)評價1.阿司匹林抑制乙酰肝素酶介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲行為HTRF酶活檢測實驗明確了阿司匹林對腫瘤細(xì)胞中乙酰肝素酶的酶活功能具有抑制作用。細(xì)胞水平檢測表明阿司匹林可以抑制乙酰肝素酶引起的相關(guān)效應(yīng),可劑量依賴性地抑制多種腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲。同時,高表達(dá)乙酰肝素酶、干擾乙酰肝素酶或者外源加入乙酰肝素酶均能夠逆轉(zhuǎn)阿司匹林的抑制腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲的作用。2.阿司匹林抑制乙酰肝素酶介導(dǎo)的細(xì)胞黏附免疫熒光實驗表明阿司匹林能夠抑制外源加入乙酰肝素酶誘導(dǎo)的syndecan-1內(nèi)化過程。提示了阿司匹林能夠影響乙酰肝素酶介導(dǎo)的細(xì)胞黏附。乙酰肝素酶高表達(dá)引起Rac-1和Rho A的活化進(jìn)而誘導(dǎo)F-actin重排及偽足的形成,最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的黏附。免疫熒光和蛋白檢測均表明阿司匹林能夠抑制這一現(xiàn)象從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞黏附的作用。3.阿司匹林抑制乙酰肝素酶介導(dǎo)的血管新生通過ELISA法檢測VEGF的釋放顯示,阿司匹林能夠劑量依賴性地抑制腫瘤細(xì)胞對于VEGF的釋放。同樣高表達(dá)或者干擾乙酰肝素酶均能逆轉(zhuǎn)阿司匹林的抑制作用。采用多種新生血管生成評價模型,我們對阿司匹林的康血管新生作用進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示：阿司匹林能夠在體外無細(xì)胞毒濃度下即顯著抑制HUVEC的管腔形成,濃度為4mM時,抑制效果最顯著,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)幾乎完全消失,抑制率達(dá)60.8%。同時,阿司匹林能夠顯著抑制大鼠動脈環(huán)的血管萌芽以及雞胚尿囊膜血管新生。4.阿司匹林抑制乙酰肝素酶介導(dǎo)的信號通路活化乙酰肝素酶高表達(dá)能夠引起相關(guān)通路活化如STA3、STAT5、Src、Erk等活化,上調(diào)其磷酸化水平。阿司匹林處理細(xì)胞后,western blot結(jié)果顯示,阿司匹林能夠時間及劑量依賴性地抑制上述信號通路的活化,下調(diào)其磷酸化水平。第三部分阿司匹林對乙酰肝素酶介導(dǎo)的體內(nèi)生物學(xué)效應(yīng)評價基于阿司匹林的體外抑制乙酰肝素酶相關(guān)效應(yīng),我們運用動物模型進(jìn)一步評價阿司匹林抑制轉(zhuǎn)移和血管新生的作用。結(jié)果表明,阿司匹林以62.5、125、250mg/kg口服給藥,能夠顯著抑制B16F10的肺轉(zhuǎn)移,抑制率分別為19.9%,49.6%和65.5%。在MDA-MB-435模型中,125、250mg/kg口服給藥也顯示出抑制腫瘤生長的作用,T/C分別為61.69%和47.79%。以內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記物CD31為指標(biāo),免疫組化結(jié)果顯示,阿司匹林治療后腫瘤組織中新生血管數(shù)目明顯減少,下降了44.48%和66.9%。對腫瘤組織進(jìn)行western blot檢測,結(jié)果顯示阿司匹林能夠抑制STAT3等的活化,這一結(jié)果與細(xì)胞水平結(jié)果一致。另外我們在阿司匹林治療組的腫瘤組織中觀察到乙酰肝素酶表達(dá)的下調(diào),為此我們對腫瘤細(xì)胞采取長時間加藥刺激處理,同樣觀察到阿司匹林長時間作用之后,隨著劑量的增加同樣能夠下調(diào)乙酰肝素酶的蛋白表達(dá)水平。但是,RQ-PCR檢測發(fā)現(xiàn)阿司匹林作用后乙酰肝素酶的mRNA水平上調(diào)。這一結(jié)果表明阿司匹林可能是通過促進(jìn)降解來下調(diào)乙酰肝素酶的蛋白表達(dá),利用蛋白酶抑制劑的回轉(zhuǎn)實驗也驗證了這一結(jié)果。結(jié)論：本文證明了阿司匹林可能通過與乙酰肝素酶的Glu225酶活相關(guān)區(qū)域結(jié)合來抑制其酶活性,進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤轉(zhuǎn)移與血管新生的作用。同時阿司匹林兼具乙酰肝素酶非酶活功能抑制作用。本研究證實了乙酰肝素酶為阿司匹林的作用靶點,并全面評價了阿司匹林針對乙酰肝素酶的抗轉(zhuǎn)移作用特性,為全面認(rèn)識阿司匹林抗腫瘤作用機(jī)制提供了新的理論基礎(chǔ),同時也為乙酰肝素酶小分子抑制劑的研發(fā)提供了新的方向。
[Abstract]:The aim of this study was to investigate the effect of heparan sulfate on anti - tumor metastasis of aspirin .
Aspirin inhibits heparanase - mediated cell adhesion . It is suggested that aspirin can inhibit the migration and invasion of heparanase .

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96

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本文編號：1894897