本文選題：肝纖維化 + 熒光素酶報告基因�。� 參考：《藥學(xué)學(xué)報》2015年02期

【摘要】：為了有效篩選潛在的抗肝纖維化藥物,本實(shí)驗(yàn)室建立了基于COL1A1啟動子的高通量篩選細(xì)胞模型。該細(xì)胞模型在TGF-β1的刺激下,激活COL1A1啟動子及熒光素酶報告基因的表達(dá),而該激活作用可以被候選化合物抑制。作者首先構(gòu)建COL1A1啟動子和熒光素酶報告載體p GL4.17的重組質(zhì)粒。采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)對該啟動子的活性進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒比對照組熒光素酶活性高15.98倍。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人肝星狀細(xì)胞株LX2中,用無限稀釋法得到單克隆細(xì)胞株,并利用活體成像儀篩選出穩(wěn)定表達(dá)COL1A1啟動子的單克隆細(xì)胞株LX2-COL。經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后檢測該單克隆細(xì)胞株LX2-COL對候選化合物(S1~S7)的反應(yīng)性,其中S7對啟動子活性抑制作用最強(qiáng)。Real-time RT-PCR和Western blotting驗(yàn)證了經(jīng)該細(xì)胞模型篩選得到的化合物S7能夠抑制Ⅰ型膠原m RNA和蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果表明,該細(xì)胞模型的建立能夠?qū)崿F(xiàn)對潛在的抗肝纖維化化合物的高通量篩選。
[Abstract]:In order to screen potential antifibrotic drugs effectively, a high throughput screening cell model based on COL1A1 promoter was established. The cell model stimulated by TGF- 尾 1 activates the expression of COL1A1 promoter and luciferase reporter gene, which can be inhibited by candidate compounds. The authors first constructed the recombinant plasmid of COL1A1 promoter and luciferase report vector p GL4.17. Double luciferase reporter gene detection system was used to detect the activity of the promoter. It was found that the activity of the recombinant plasmid was 15.98 times higher than that of the control group. The plasmid was transfected into human hepatic stellate cell line LX2. The monoclonal cell line LX2-COL, which expressed COL1A1 promoter stably, was obtained by infinite dilution method. After induction by TGF- 尾 1, the reactivity of the monoclonal cell line LX2-COL to the candidate compound S1, S7, was detected. Among them, S7 had the strongest inhibitory effect on promoter activity. Real-time RT-PCR and Western blotting confirmed that S7 could inhibit the expression of type I collagen m RNA and protein. The results showed that the cell model could achieve high throughput screening of potential anti-hepatic fibrosis compounds.
【作者單位】： 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所;
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81170409) 中國肝炎防治基金會-王寶恩肝纖維化研究基金資助課題(20110026) 國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2012ZX09301002-001)
【分類號】：R963

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本文編號：1846202