本文選題：ADAM12-L + ADAM12-S　； 參考：《蘇州大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：研究背景和目的:去整合素金屬蛋白酶(ADAMs,A Disintegrin And Metalloproteinases)家族是一類含有前肽結(jié)構(gòu)域、金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、去整合素結(jié)構(gòu)域、富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域、膜近端上皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域等多個結(jié)構(gòu)域的鋅離子依賴的跨膜糖蛋白水解酶,它們參與多種生物學(xué)過程,包括蛋白水解、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞粘連、遷移等,并與腫瘤的發(fā)生和侵襲密切相關(guān)。人源ADAM12定位于染色體10q26.3,具有典型的ADAM家族蛋白的結(jié)構(gòu)序列�，F(xiàn)有臨床研究發(fā)現(xiàn)ADAM12在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。目前已發(fā)現(xiàn)該水解酶可以水解一些特定的底物蛋白,如Heparin-binding EGF-like growth factor(HB-EGF)、Delta-like 1、Ephrin-A1等。用小分子藥物抑制其水解活性,可以抑制HB-EGF的脫落,使心肌肥大癥狀減緩,這說明了ADAM12的水解功能在疾病發(fā)生發(fā)展過程中的重要性。但ADAM12是如何調(diào)節(jié)下游蛋白來實現(xiàn)其功能、促進腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移等問題還不清楚。本論文中,我們以ADAM12為研究對象,通過液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀高通量篩選在腫瘤細(xì)胞中與ADAM12相互作用的蛋白,并探究這些蛋白與ADAM12的相互調(diào)控關(guān)系。研究方法:首先構(gòu)建了帶FLAG標(biāo)簽的ADAM12的兩個亞型ADAM12-L和ADAM12-S的質(zhì)粒。在人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞中過表達(dá)ADAM12-L和ADAM12-S并收集細(xì)胞提取蛋白,然后用與共價結(jié)合FLAG抗體的微珠進行免疫共沉淀,純化富集并洗脫與ADAM12-L和/或ADAM12-S相互作用的蛋白,再通過蛋白免疫印跡方法驗證蛋白表達(dá)及純化效率。將純化后的蛋白用SDS-PAGE分離并銀染,找到實驗組與對照組有差異的條帶,膠內(nèi)用胰蛋白酶酶解成多肽后,用LC-MS/MS質(zhì)譜分析,通過數(shù)據(jù)庫搜索獲得與ADAM12-L和/或ADAM12-S相互作用的蛋白。通過生物信息學(xué)方法分析這些蛋白的已知功能,預(yù)測ADAM12可能參與的生物學(xué)過程及其生物學(xué)功能。最后通過生物化學(xué)方法驗證這些蛋白與ADAM12-L和/或ADAM12-S的相互作用并探究其在腫瘤細(xì)胞中與ADAM12-L和/或ADAM12-S的相互調(diào)控關(guān)系。研究結(jié)果:在兩次生物學(xué)重復(fù)實驗中,通過質(zhì)譜分析我們共發(fā)現(xiàn)了297個與ADAM12-L相互作用的蛋白,其中有33個蛋白在兩次實驗中均存在;同時,共發(fā)現(xiàn)149個與ADAM12-S相互作用的蛋白,其中的13個蛋白在兩次生物學(xué)重復(fù)中均被發(fā)現(xiàn),在這13個蛋白里,有11個與ADAM12-S特異性相互作用。ADAM12的不同亞型有其特異性相互作用的蛋白,預(yù)示著它們不同的功能。生物化學(xué)方法驗證了myoferlin、vimentin和endoplasmin(GRP94)與ADAM12-L或ADAM12-S的相互作用。許多與ADAM12相互作用的蛋白與腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)。另外,過表達(dá)實驗發(fā)現(xiàn)ADAM12-L可以上調(diào)其相互作用蛋白vimentin的表達(dá),且無酶活性的突變體ADAM12-L-E351Q也可以上調(diào)vimentin蛋白的表達(dá),程度與野生型ADAM12-L接近。而myoferlin則可以通過影響ADAM12-L的穩(wěn)定性,上調(diào)未成熟型的ADAM12-L的表達(dá)并使其降解速度明顯變緩,但對成熟型的ADAM12-L影響不大;當(dāng)通過siRNA敲低myoferlin后,兩種形式的ADAM12-L的表達(dá)都有所減少。分子伴侶GRP94則對ADAM12-S的分泌有著重要的調(diào)節(jié)作用,用siRNA敲低GRP94使其蛋白表達(dá)水平降低后,發(fā)現(xiàn)分泌到培養(yǎng)基中的ADAM12-S明顯減少。研究結(jié)論:通過無標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)高通量篩選獲得297個ADAM12-L相互作用的蛋白,149個與ADAM12-S相互作用的蛋白,并通過免疫印跡的方法驗證其中的一些蛋白,同時發(fā)現(xiàn)它們與ADAM12-L或ADAM12-S之間的相互調(diào)控關(guān)系。我們的實驗發(fā)現(xiàn)ADAM12-L很有可能是連接腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的蛋白myoferlin和vimentin的關(guān)鍵蛋白,同時也揭示了ADAM12-L的非酶活性功能。這些發(fā)現(xiàn)對我們研究ADAM12-L在腫瘤細(xì)胞中參與的信號通路,揭示其調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲的分子機制等有很大的幫助。GRP94可以調(diào)節(jié)ADAM12-S從細(xì)胞分泌到細(xì)胞外,ADAM12-S的分泌降解細(xì)胞外基質(zhì),與其促進腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān),這可以幫助我們揭示ADAM12-S使腫瘤細(xì)胞侵襲力增加的分子機制。
[Abstract]:In this paper , we have found that the proteolytic enzyme can hydrolyze some specific substrate proteins , such as heparin - binding EGF - like growth factor ( HB - EGF ) , Delta - like 1 , Ephrin - A1 , etc . In addition , it has been found that the expression of vimentin can be regulated by means of high throughput screening . In addition , it is possible to increase the expression of vimentin by means of high throughput screening .

【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R96

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本文編號：1845829