本文選題：二甲雙胍 + 嗎啡耐受　； 參考：《南京醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：嗎啡(morphine)為阿片受體激動(dòng)劑,因其強(qiáng)大的鎮(zhèn)痛作用成為臨床廣泛應(yīng)用的強(qiáng)效鎮(zhèn)痛藥。然而,嗎啡耐受及其副作用嚴(yán)重限制了臨床應(yīng)用。長(zhǎng)期應(yīng)用嗎啡后其鎮(zhèn)痛作用逐漸減弱,必須增加劑量才能得到原來(lái)的反應(yīng),即產(chǎn)生嗎啡耐受(Morphine tolerance)。嗎啡耐受迫使患者增加藥量,進(jìn)而更增加了嗎啡的副作用。因此探討嗎啡耐受的機(jī)制,有效地防治嗎啡耐受是基礎(chǔ)和臨床研究共同面臨的挑戰(zhàn)。近年來(lái)研究以及我們前期的研究發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥在嗎啡耐受過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia)和星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte)的激活是神經(jīng)炎癥的主要特征,嗎啡可通過(guò)直接或間接地方式激活膠質(zhì)細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞上都有u,δ和K阿片類(lèi)受體表達(dá),但是關(guān)于嗎啡激活膠質(zhì)細(xì)胞是否直接通過(guò)這些受體尚不明確。在一些體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),嗎啡可以直接影響膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)或功能。也有研究發(fā)現(xiàn),嗎啡可以通過(guò)TLR4直接激活膠質(zhì)細(xì)胞。且小膠質(zhì)細(xì)胞的抑制劑米諾環(huán)素可以顯著抑制嗎啡耐受,鑒于米諾環(huán)素有很?chē)?yán)重的副作用,無(wú)法用于臨床,因此找到一個(gè)安全有效的抑制小膠質(zhì)細(xì)胞異常活化藥物是治療嗎啡耐受的關(guān)鍵。二甲雙胍(Metformin)為雙胍類(lèi)口服降血糖藥,臨床應(yīng)用有著良好的安全性。二甲雙胍起效的分子機(jī)制與AMPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)有關(guān)。AMPK是一個(gè)位于真核細(xì)胞中的絲氨酸-蘇氨酸激酶,是細(xì)胞中感受能量應(yīng)激并調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝的關(guān)鍵分子。而最近的研究發(fā)現(xiàn),AMPK的激動(dòng)劑白藜蘆醇可以顯著抑制嗎啡誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥,并改善嗎啡耐受。由此可見(jiàn),AMPK與嗎啡耐受有密切關(guān)系,但是,二甲雙胍是否是通過(guò)激活A(yù)MPK從而通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的活性以及相關(guān)神經(jīng)炎癥來(lái)減輕嗎啡耐受,尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此,我們通過(guò)體外培養(yǎng)BV-2、bEND3和在體嗎啡耐受模型,對(duì)二甲雙胍在嗎啡耐受中的作用機(jī)制進(jìn)行研究。第一部分二甲雙胍抑制嗎啡誘導(dǎo)體外細(xì)胞活化的胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制目的：研究二甲雙胍抑制嗎啡誘導(dǎo)bEND3內(nèi)皮細(xì)胞、BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活化的胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制方法：培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞系bEND3細(xì)胞,利用QPCR的方法,在細(xì)胞水平上考察嗎啡對(duì)于前炎癥因子IL-1β、 IL-6、TNF-α釋放,以及TLR4和趨化因子CCL2的影響,并考察二甲雙胍對(duì)這些變化的影響；培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2細(xì)胞,利用QPCR的方法,在細(xì)胞水平上考察嗎啡對(duì)于前炎癥因子IL-1β、 IL-6、TNF-α釋放的影響,并考察二甲雙胍對(duì)這些變化的影響；利用免疫印跡的方法考察嗎啡對(duì)p38磷酸化水平的影響,并考察二甲雙胍對(duì)其的影響；利用細(xì)胞熒光染色考察嗎啡對(duì)NF-κB核轉(zhuǎn)位的影響,并考察二甲雙胍對(duì)于其的作用；QPCR法檢測(cè)二甲雙胍對(duì)嗎啡誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞TLR4 mRNA水平上升的影響。結(jié)果：二甲雙胍可以顯著抑制嗎啡誘導(dǎo)的bEND細(xì)胞IL-6的異常升高,但是嗎啡及二甲雙胍對(duì)于TNF-α、IL-1β、TLR4和CCL2無(wú)顯著影響。嗎啡能誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞強(qiáng)烈活化,其活化的表征為p38 MAPK磷酸化水平升高、NF-κB核移位和前炎癥細(xì)胞因子(包括IL-1β、IL-6和TNF-α) mRNA表達(dá)增加,而二甲雙胍可以顯著抑制這些改變,且AMPK抑制劑可以取消二甲雙胍的作用；同時(shí)二甲雙胍可以抑制嗎啡誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞中TLR4 mRNA水平的上升。第二部分二甲雙胍對(duì)嗎啡耐受小鼠行為學(xué)、脊髓神經(jīng)化學(xué)及小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響目的：研究二甲雙胍對(duì)嗎啡耐受行為學(xué)的影響及其作用機(jī)制方法：測(cè)定經(jīng)典的疼痛行為學(xué)指標(biāo)——小鼠甩尾潛伏期,考察二甲雙胍對(duì)嗎啡耐受行為學(xué)的影響；利用免疫印跡法檢測(cè)二甲雙胍對(duì)于嗎啡慢性耐受標(biāo)志性分子指標(biāo)NR1、PKCγ、 p38的影響：利用免疫印跡法檢測(cè)二甲雙胍對(duì)慢性耐受模型脊髓前炎癥因子IL-1β和TNF-α的影響；利用免疫印記和免疫熒光法檢測(cè)二甲雙胍對(duì)于脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度的影響。結(jié)果：二甲雙胍能緩解慢性嗎啡耐受的發(fā)展,并能抑制嗎啡誘導(dǎo)的脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化和p38 MAPK磷酸化水平升高；二甲雙胍能抑制嗎啡慢性耐受引起的脊髓前炎癥因子IL-1p和TNF-α的異常升高；二甲雙胍能抑制嗎啡慢性耐受引起的NP1和PKCγ磷酸化水平的異常升高。結(jié)論：二甲雙胍能通過(guò)抑制p38 MAPK信號(hào)通路,進(jìn)而抑制嗎啡誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化,使得其能緩解嗎啡慢性耐受。二甲雙胍可能成為預(yù)防、最小化甚至逆轉(zhuǎn)嗎啡誘導(dǎo)的耐受和其它副作用的潛在臨床靶點(diǎn),促進(jìn)阿片類(lèi)藥物的臨床應(yīng)用。
[Abstract]:morphine ( morphine ) is an opioid receptor agonist , which is a potent analgesic for clinical application because of its strong analgesic effect . However , morphine tolerance and its side effects severely limit the clinical application . After long - term use of morphine , its analgesic effect is gradually weakened , and the dose can be increased to get the original response , i . e . morphine tolerance . In recent years , it is found that morphine can directly or indirectly activate glial cells .
The effects of morphine on the release of IL - 1尾 , IL - 6 and TNF - 偽 were investigated by QPCR , and the effects of metformin on these changes were investigated .
The effect of morphine on p38 phosphorylation was investigated by Western blot .
The effect of morphine on the nuclear translocation of NF - 魏B was investigated by means of cell fluorescence staining , and the effect of metformin on NF - 魏B nuclear translocation was investigated .
The results showed that metformin could significantly inhibit the increase of IL - 6 in BEND cells induced by morphine , but morphine and metformin had no significant effect on the levels of TNF - 偽 , IL - 1尾 , TLR 4 and CCL2 . The activation of morphine and metformin increased the expression of p38 MAPK phosphorylation , and the expression of NF - 魏B nuclear translocation and pro - inflammatory cytokines ( including IL - 1尾 , IL - 6 and TNF - 偽 ) mRNA increased , while metformin could significantly inhibit these changes and AMPK inhibitors could abolish metformin .
The effects of metformin on morphine tolerance behavior , spinal neurochemistry and activation of microglial cells were studied . The effects of metformin on morphine tolerance behavior and its mechanism were studied .
The effect of metformin on the molecular markers NR1 , PKC緯 and p38 in chronic morphine tolerance was investigated by Western blotting . The effects of metformin on the levels of IL - 1尾 and TNF - 偽 were detected by Western blotting .
The results showed that metformin could alleviate the development of chronic morphine tolerance and inhibit the activation of morphine - induced microglial cells and the increase of p38 MAPK phosphorylation .
Metformin inhibited the abnormal elevation of IL - 1p and TNF - 偽 in the spinal cord induced by chronic morphine tolerance .
Conclusion : Metformin can inhibit the activation of morphine - induced microglial cells by inhibiting p38 MAPK signaling pathway , thus inhibiting the activation of morphine - induced microglial cells . Metformin may be a potential clinical target to prevent , minimize or even reverse morphine - induced tolerance and other side effects , and to promote clinical use of opioids .

【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R96

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