本文選題：PEP-1-MIT-hSOD2 + K29R　； 參考：《暨南大學》2017年碩士論文

【摘要】：目的:將蛋白轉(zhuǎn)導域(PTD)PEP-1和線粒體定位的人錳超氧化物歧化酶突變體(hSOD2K29R)進行融合表達,并研究線粒體靶向抗氧化蛋白PEP-1-MIT-hSOD2 K29R突變體對MPP~+損傷SH-SY5Y細胞的帕金森病(PD)細胞模型的保護作用。方法:利用生物軟件SYBYL,ClustalX或者在線預測平臺Swiss-model,HOT-MUSIC等分析預測出18個活力或者穩(wěn)定性增大的hSOD2突變體,利用野生型pET-15b-hSOD2質(zhì)粒為模板,通過PCR構建18個含定點突變的融合表達載體,并分別轉(zhuǎn)入表達宿主,進行百草枯(PQ)抗性篩選,篩選出活力增大的突變體,電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICPMS)檢測Mn~(2+)結(jié)合能力,SOD活力試劑盒檢測在不同濃度變性劑SDS以及不同溫度,不同pH條件下處理1h后的活力變化。并構建pET-15b-PEP-1-MIT-hSOD2突變體融合表達載體。使用E.coliBL21作為宿主進行蛋白表達,使用Ni-NTA純化蛋白。MTT【3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽】法檢測融合蛋白對1000μMMPP~+誘導的SH-SY5Y細胞PD模型的保護作用和融合蛋白對SH-SY5Y細胞的毒性作用。免疫熒光法驗證融合蛋白PEP-1-MIT-hSOD2突變體在SH-SY5Y細胞中線粒體定位作用。2'7'二氯熒光素二醋酸鹽(DCF-DA)探針檢測融合蛋白對PD細胞模型ROS的影響。Real-timePCR檢測融合蛋白PEP-1-MIT-hSOD2突變體對PD細胞模型的炎癥因子和凋亡因子影響。結(jié)果:(1)成功構建了18個pET-15b-hSOD2的突變體表達載體,并利用比較表達不同hSOD2突變體的E.coli的百草枯抗性篩選出活力最可能增強的hSOD2突變體K29R。(2)三維建模發(fā)現(xiàn),hSOD2K29R活性中心Mn~(2+)到與其結(jié)合氨基酸H74的N1原子鍵長變短,由2.05?變到2.01?。ICPMS檢測出Mn~(2+)結(jié)合量為0.966±0.025mol/molprotein,與野生型相比增加1.05倍。hSOD2K29R在高溫、不同pH或不同濃度SDS處理1h后,活力比野生型蛋白大。(3)構建了pET-15b-PEP-1-MIT-hSOD2 K29R融合表達載體,獲得分子量大小為29.8kDa的蛋白,產(chǎn)量為每升LB培養(yǎng)基可表達59mg蛋白,純度在90%以上。(4)MTT檢測發(fā)現(xiàn)PEP-1-MIT-hSOD2 K29R融合蛋白可以使MPP~+誘導的SH-SY5Y細胞的存活率由53.4%增加到81.6%,且無明顯的細胞毒性。(5)PEP-1-MIT-hSOD2 K29R融合蛋白可以穿過SH-SY5Y細胞的細胞膜并進入線粒體,并降低MPP~+誘導產(chǎn)生的ROS。1μMPEP-1-MIT-hSOD2 K29R蛋白可以使MPP~+引起的SH-SY5Y細胞的炎癥因子TNF-α,IL-6和凋亡因子Bax的表達下調(diào),使抑制凋亡因子Bcl-2的表達上調(diào),調(diào)高Bcl-2和Bax的比例。結(jié)論:成功篩選出活力增大的hSOD2突變體hSOD2 K29R。設計并表達出PEP-1-MIT-hSOD2 K29R融合蛋白,它可以較好的清除MPP~+誘導產(chǎn)生的ROS,并且可以穿過細胞膜并定位線粒體定位功能,可以下調(diào)PD細胞模型炎癥因子TNF-α和IL-6的表達,調(diào)高PD細胞模型Bcl-2和Bax的比例,PEP-1-MIT-hSOD2 K29R融合蛋白有望開發(fā)成為抗PD的新藥。
[Abstract]:Objective: to fuse the protein transduction domain (PTD) PEP-1 and mitochondrial mutants of human manganese superoxide dismutase (hSOD2K29R), and to study the protective effect of mitochondrial targeting antioxidant protein PEP-1-MIT-hSOD2 K29R mutant on the Parkinson's disease (PD) cell model of MPP~+ damaged SH-SY5Y cells. Method: using the biological software SYBYL, Clus. TalX or online prediction platform Swiss-model, HOT-MUSIC and other analyses predicted 18 active or stable hSOD2 mutants. Using the wild type pET-15b-hSOD2 plasmid as the template, 18 fusion expression vectors containing fixed point mutation were constructed by PCR and transferred into the expression host respectively. The resistance screening of paraquat (PQ) was screened and the vitality increased. The mutant, inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS) was used to detect Mn~ (2+) binding ability. SOD activity kit was used to detect the activity changes of 1h after different concentration of denaturant SDS and different temperatures and pH conditions. The expression vector of pET-15b-PEP-1-MIT-hSOD2 mutant was constructed. E.coliBL21 was used as the host for protein expression. The Ni-NTA purified protein.MTT [3- (4,5- two methyl thiazole -2) -2,5- two phenyl tetrazolium bromide] was used to detect the protective effect of fusion protein on the PD model of SH-SY5Y cells induced by 1000 mu MMPP~+ and the toxic effect of the fusion protein on SH-SY5Y cells. The effect of.2'7'two chloro fluorescein two acetate (DCF-DA) probe on the effect of fusion protein on the PD cell model ROS. The effect of.Real-timePCR detection of the fusion protein PEP-1-MIT-hSOD2 mutant on the inflammatory factors and apoptosis factors of the PD cell model. Results: (1) the mutant expression vector of 18 pET-15b-hSOD2 was successfully constructed, and the utilization ratio of the mutant protein was successfully constructed. The most likely enhanced hSOD2 mutant K29R. (2) three-dimensional modeling was found to be more likely to be enhanced by the E.coli paraquat resistance of different hSOD2 mutants. It was found that the N1 atomic bond length of the hSOD2K29R active center Mn~ (2+) to its binding amino acid H74 was shorter, from 2.05 to 2.01?.ICPMS. The Mn~ (2+) binding amount was 0.966 +. Compared with the increase of 1.05 times.HSOD2K29R at high temperature, different pH or different concentrations of SDS treated 1H, the activity was larger than that of the wild type protein. (3) the pET-15b-PEP-1-MIT-hSOD2 K29R fusion expression vector was constructed and the protein of the molecular weight of 29.8kDa was obtained. The yield of the protein was expressed as 59mg protein per liter LB culture base, and the purity was above 90%. (4) MTT detection PEP-1-MI was found. T-hSOD2 K29R fusion protein can increase the survival rate of SH-SY5Y cells induced by MPP~+ from 53.4% to 81.6%, without obvious cytotoxicity. (5) PEP-1-MIT-hSOD2 K29R fusion protein can pass through the cell membrane of SH-SY5Y cells and enter mitochondria, and the ROS.1 micron MPEP-1-MIT-hSOD2 K29R protein induced by MPP~+ can cause MPP~+ to cause MPP~+. The expression of TNF- alpha, IL-6 and apoptotic factor Bax was down regulated in the SH-SY5Y cells. The expression of the inhibitor of the apoptotic factor Bcl-2 was up-regulated and the ratio of Bcl-2 and Bax increased. Conclusion: the hSOD2 K29R. of the hSOD2 mutant was successfully screened and expressed the PEP-1-MIT-hSOD2 K29R fusion protein. ROS, which can pass through the cell membrane and locate the mitochondrial localization function, can downregulate the expression of the inflammatory factors TNF- A and IL-6 in the PD cell model, and increase the proportion of Bcl-2 and Bax in the PD cell model, and the PEP-1-MIT-hSOD2 K29R fusion protein is expected to be a new drug for anti PD.

【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R915;R96

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本文編號：1793220