本文選題：cRGD-siRNA + VEGFR2　； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：腫瘤生長依賴于新血管生成,當(dāng)腫瘤組織擁有獨(dú)立的血管供應(yīng),腫瘤細(xì)胞就獲得了轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的能力。RNA干擾(RNA interference,RNAi)作為一項(xiàng)新興技術(shù),被廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的基因治療研究領(lǐng)域。本課題設(shè)計(jì)合成cRGD-siVEGFR2分子,考察分子體外生物學(xué)功能,探討其抑制血管生成的作用效果及作為腫瘤靶向治療藥物的可能性。方法1、原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞模型的建立膠原酶消化法分離提取細(xì)胞,免疫熒光檢測(cè)Ⅷ因子進(jìn)行細(xì)胞鑒定,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD31含量進(jìn)行純度檢測(cè),并探索最佳的血清饑餓條件。2、cRGD-siRNA分子的合成cRGD通過linker與siRNA正義鏈5'端共價(jià)偶聯(lián)得cRGD-siRNA分子,分別用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和反相高效液相色譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和純度檢測(cè)。3、cRGD-siVEGFR2分子體外功能研究(1)血清穩(wěn)定性研究:siVEGFR2、cRGD-siVEGFR2、cRGD-siNC 分別與鼠血清混勻孵育,瓊脂糖凝膠電泳后觀察條帶完整性。(2)細(xì)胞毒性研究:1000nM、2000nM、3000nMRPM 或 cRGD-siNC 分子轉(zhuǎn)染細(xì)胞,CCK8測(cè)定細(xì)胞活力。(3)靶向沉默功能研究:100nM、500nM、800nM、1000nM cRGD-siVEGFR2、陽性對(duì)照 Lipo/siVEGFR2(100nM)、Lipo/cRGD-siVEGFR2(100nM)、陰性對(duì)照cRGD-siNC(1000nM)轉(zhuǎn)染細(xì)胞,RT-PCR法和western-blot法檢測(cè)分子靶向沉默效果。(4)對(duì)細(xì)胞增殖遷移的影響:100nM、500nM、800nM、1000nM cRGD-siVEGFR2、Lipo/siVEGFR2、cRGD-siNC 轉(zhuǎn)染細(xì)胞,CCK8 法和 EdU 法測(cè)定細(xì)胞增殖活力,劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移能力。(5)對(duì)細(xì)胞體外成管的影響:1000nM cRGD-siVEGFR2、Lipo/siVEGFR2、cRGD-siNC轉(zhuǎn)染細(xì)胞后接種于基質(zhì)膠上進(jìn)行細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn),觀察小管形成情況。結(jié)果1、原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞提取成功,細(xì)胞呈多邊形,鋪卵石狀排列。Ⅷ因子呈陽性表達(dá),CD31含量高為99.67%。不同血清濃度培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)細(xì)胞6h可得到70%左右G0/G1期細(xì)胞;12h可得80%～90%;18h、24h可得95%左右。2、cRGD-siRNA分子合成成功,其實(shí)測(cè)分子質(zhì)量與理論分子質(zhì)量基本一致,純度約為80%。3、cRGD-siVEGFR2分子體外功能研究(1)血清穩(wěn)定性:siVEGFR2分子24h幾乎完全降解,而cRGD-siVEGFR2與cRGD-siNC分子72h僅有部分降解。(2)細(xì)胞毒性:RPM分子組O.D.值保持在1.0左右;cRGD-siNC組O.D.值保持在0.85以上,1000nM時(shí)O.D.值在1.0左右。(3)靶向沉默功能:cRGD-siVEGFR2分子可以下調(diào)VEGFR2mRNA和蛋白的表達(dá),且其作用呈濃度依賴。(4)對(duì)細(xì)胞增殖遷移的影響:cRGD-siVEGFR2分子可呈時(shí)間和濃度依賴的抑制細(xì)胞增殖遷移。(5)對(duì)細(xì)胞體外成管的影響:HUVECs在基質(zhì)膠上生長6h可形成條索狀結(jié)構(gòu),生成分支,并閉合成管。cRGD-siVEGFR2分子可以有效減少管狀結(jié)構(gòu)形成。結(jié)論1、膠原酶消化法可收獲高質(zhì)量的HUVECs,無血清培養(yǎng)12h為最佳饑餓條件。2、cRGD通過linker與siRNA正義鏈5'端共價(jià)偶聯(lián),可得到純度高、穩(wěn)定性好、基本無毒的cRGD-siRNA分子。3、cRGD-siVEGFR2分子可以靶向沉默目的基因mRNA及蛋白的表達(dá),有效抑制HUVECs的細(xì)胞增殖遷移及體外成管。
[Abstract]:Tumor growth depends on neovascularization. When tumor tissues have independent vascular supply, tumor cells acquire the ability of metastasis and diffusion. RNA interference RNA interference RNAi (RNAi), as a new technology, has been widely used in gene therapy of malignant tumors.In this paper, we designed and synthesized cRGD-siVEGFR2 molecule, investigated its biological function in vitro, and discussed the effect of inhibiting angiogenesis and the possibility of using it as tumor target therapy.Methods 1. The primary human umbilical vein endothelial cell model was established. Collagenase digestion method was used to isolate and extract cells. Factor 鈪，

本文編號(hào)：1772427