本文選題：糖胺聚糖　切入點(diǎn)：毛細(xì)管電泳　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：糖胺聚糖是一類由重復(fù)二糖結(jié)構(gòu)單元組成的線性長鏈大分子多糖,包括肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、透明質(zhì)酸和硫酸角質(zhì)素等。糖胺聚糖來源豐富、結(jié)構(gòu)多樣,具有多種生物活性和藥理作用,在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。糖胺聚糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分離困難,要獲得完全單一種類的糖胺聚糖十分困難。不同結(jié)構(gòu)糖胺聚糖的藥理作用不同,肝素鈉事件的發(fā)生使得各國對糖胺聚糖的分析測定尤為重視,因此建立一種快速、準(zhǔn)確的糖胺聚糖分離測定方法對其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制十分重要。硫酸軟骨素在骨關(guān)節(jié)炎的治療領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用,但不同來源硫酸軟骨素的結(jié)構(gòu)存在微小差別,這一差別可導(dǎo)致其活性的差異。因此,建立一種快速鑒別硫酸軟骨素來源的方法意義重大。糖胺聚糖是一種內(nèi)源性的生物大分子,人體內(nèi)糖胺聚糖的濃度水平和健康狀況密切相關(guān)。目前糖胺聚糖已作為保健品和藥品口服或注射使用,但其給藥后在體內(nèi)的存在方式仍存在爭議,糖胺聚糖的藥代動力學(xué)參數(shù)多是通過測定其二糖含量獲得的,并不能體現(xiàn)糖胺聚糖分子在體內(nèi)的濃度水平,因此建立一種血漿中糖胺聚糖的分析測定方法對疾病診斷、治療藥物監(jiān)測和糖胺聚糖的藥代動力學(xué)研究有重要意義。目前,關(guān)于糖胺聚糖的分離測定多采用化學(xué)降解或酶降解的方法,對降解后產(chǎn)生的單糖或多糖進(jìn)行分析,操作繁瑣復(fù)雜,且不能準(zhǔn)確反映出體內(nèi)未降解糖胺聚糖分子的濃度水平。因此,本研究致力于建立快速、準(zhǔn)確的糖胺聚糖的分析方法,具體研究內(nèi)容如下。1.本文在前人的工作基礎(chǔ)上建立了一種采用金納米棒作為假固定相的分離硫酸軟骨素和硫酸皮膚素的毛細(xì)管電泳法。實(shí)驗(yàn)考察了不同種類的緩沖溶液,最終選取了乙二胺-磷酸緩沖溶液。實(shí)驗(yàn)還考察了緩沖液pH、濃度、分離電壓和不同大小、形態(tài)的納米金材料對硫酸軟骨素和硫酸皮膚素分離的影響,結(jié)果表明不同種類和粒徑的納米金材料對分離的影響不同。優(yōu)化后的電泳條件為：分離體系為含30%(v/v)金納米棒和20 mmol/L磷酸二氫鈉的150 mmol/L乙二胺-磷酸緩沖溶液(pH 4.5),分離電壓為-10 kV,采用內(nèi)徑50 μm、有效長度為49 cm、總長度為59.2 cm的熔融石英毛細(xì)管,柱溫為25℃,紫外檢測器的檢測波長為200 nm。所建方法成功應(yīng)用于硫酸軟骨素和硫酸皮膚素的分離,硫酸軟骨素和硫酸皮膚素的遷移時間和峰面積的RSD值分別為0.13%、0.14%和0.86%、1.07%。2.本文采用Materials studio軟件對納米金和檸檬酸鈉、葡糖醛酸的相互作用進(jìn)行分子動力學(xué)模擬,待體系穩(wěn)定后計(jì)算相互作用能和擴(kuò)散系數(shù),結(jié)果表明葡糖醛酸和納米金的相互作用能大于檸檬酸,葡糖醛酸的擴(kuò)散系數(shù)大于檸檬酸鈉,在葡糖醛酸和檸檬酸鈉的競爭性吸附中,葡糖醛酸占優(yōu)勢,這與文獻(xiàn)中所得出結(jié)論一致,證明了該方法適用于糖和納米金的相互作用研究。3.本文建立了一種鑒別硫酸軟骨素來源的毛細(xì)管電泳微調(diào)控法,依據(jù)不同來源硫酸軟骨素降解后產(chǎn)生二糖種類及比例的不同可對其來源進(jìn)行鑒別。實(shí)驗(yàn)考察了分離緩沖溶液種類、底物濃度和孵育時間對分離和測定的影響,優(yōu)化后的電泳條件為：毛細(xì)管為內(nèi)徑50 μm、有效長度為50 cm、總長度為60.2 cm的熔融石英毛細(xì)管,柱溫為37℃,紫外檢測器的檢測波長為232 nm。分離緩沖液為25mmol/L硼酸鹽緩沖液(pH 9.5),孵育緩沖液為50 mmol/L Tris-60 mmol/L醋酸鈉緩沖溶液(pH 8.0),孵育緩沖溶液、硫酸軟骨素溶液、硫酸軟骨素ABC酶溶液及孵育緩沖溶液依次進(jìn)樣,其中孵育緩沖溶液于0.5 psi下進(jìn)樣10 s、硫酸軟骨素溶液和硫酸軟骨素ABC酶溶液于0.5 psi下進(jìn)樣5s,在-1 kV/+1 kV/-1 kV/+1kV各加壓6s使酶和底物充分混合,于+1.0 kV電壓、孵育8 min后,在毛細(xì)管兩端加+20 kV電壓分離酶和產(chǎn)物,其中硫酸軟骨素濃度為500 μg/mL。在優(yōu)化條件下,硫酸軟骨素二糖的分離度較好。所建方法用于不同來源硫酸軟骨素中二糖的含量的測定,將測定結(jié)果與離線方法進(jìn)行對比,結(jié)果表明所建方法可用于不同來源硫酸軟骨素的鑒別。4.本文建立了同時分離透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素和肝素的毛細(xì)管電泳法。實(shí)驗(yàn)考察了不同種類的分離緩沖溶液,最終發(fā)現(xiàn)二亞乙基三胺-磷酸緩沖體系的分離效果較好。實(shí)驗(yàn)不僅考察了緩沖液pH、濃度、分離電壓和毛細(xì)管內(nèi)徑對分離度的影響,實(shí)驗(yàn)還考察了磷酸二氫鈉濃度對分離的影響。確定的最終電泳條件為：緩沖溶液為80 mmol/L二亞乙基三胺-磷酸緩沖溶液(pH 5.0),毛細(xì)管為熔融石英管,內(nèi)徑為50μm,總長度為60.2 cm,有效長度為50 cm。檢測波長為200 nm,電泳溫度為37℃,樣品存放溫度4℃,分離電壓為-24 kV,采用壓力上樣,樣品于0.5 psi下進(jìn)樣10 s。實(shí)驗(yàn)對透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素的含量測定進(jìn)行了方法學(xué)確證,結(jié)果表明所建方法可用于三者的含量測定并成功應(yīng)用于混合多糖樣品中透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素和硫酸皮膚素的含量測定。5.本文采用優(yōu)化后的分離條件,建立了同時測定人血漿中透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素含量的毛細(xì)管電泳法。實(shí)驗(yàn)考察了多種不同提取方式,最終選用4 mol/L NaCl、氯仿和乙醇處理血漿；實(shí)驗(yàn)還考察了血漿體積對檢測靈敏度的影響,最終選取200μL血漿；最后考察了溶血對測定的影響,結(jié)果表明溶血血漿會影響硫酸軟骨素的測定。實(shí)驗(yàn)對所建方法進(jìn)行了方法學(xué)確證,其中透明質(zhì)酸的線性范圍為50 μg/mL至600 μg/mL,硫酸軟骨素的線性范圍為500 μg/mL至6000 μg/mL,精密度和準(zhǔn)確度均符合要求。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R917
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本文編號：1729693